Transfer genów za pośrednictwem Agrobacterium w roślinach Biotechnologia (z diagramem)

Transfer genów za pośrednictwem Agrobacterium w roślinach!

Agrobacterium jest Gram-ujemną patogenną bakterią zaangażowaną w wywoływanie powstawania żółci w chorobach korony u roślin. Tworzenie się korony w koronie spowodowane jest przeniesieniem segmentu onkogennego (rakotwórczego) DNA do komórki roślinnej w miejscu zranienia.

Ten segment DNA (transfer DNA lub T-DNA) jest obecny na dużym plazmidzie zwanym plazmidami indukującymi nowotwór (Ti) w bakterii. T-DNA (o długości około 20 kb) jest zintegrowany z chromosomem rośliny przez rekombinację. Seria genów wirulencji (vir) bierze udział w kierowaniu procesem infekcji. Więc kiedy korzeń rośliny lub łodyga jest zraniona, wydziela pewną odpowiedź.

W odpowiedzi na te sygnały, geny vir A tumefactions zostają aktywowane i kierują serią zdarzeń wymaganych do przeniesienia T-DNA z plazmidu Ti do chromosomu rośliny. Funkcja różnych genów vir obejmuje kopię T-DNA, a następnie przyłączenie produktu do skopiowanej nici T-DNA, aby działał jako lider, następnie dodaje białka wraz z długością T-DNA, prawdopodobnie jako ochronny mechanizm.

W końcu otwierają kanał w błonie komórkowej bakterii, przez którą przechodzi T-DNA. T-DNA następnie wchodzi do rośliny przez ranę. Jednak wciąż nie jest jasne, w jaki sposób bakteryjny DNA przemieszcza się z cytoplazmy do jądra komórki roślinnej, lub w jaki sposób T-DNA zostaje zintegrowane z chromosomami roślin.

Aby wykorzystać te bakterie jako wektor, usunięto region T-DNA z wyjątkiem regionów granicznych i genów vir. Następnie transgen wstawia się pomiędzy regiony T-DNA, gdzie jest przenoszony do komórki roślinnej i włącza się do chromosomu rośliny (ryc. 1). T-DNA jest klonowany w plazmidach Ti, które są cięte na rozmiar i replikowane w E. coli, aby ułatwić dalszą manipulację. Wektory te są mobilizowane do szczepów gospodarza Agrobacterium i stosowane do infekowania tkanek roślinnych.

Te zainfekowane tkanki roślinne są następnie hodowane na pożywkach zawierających określone chemikalia, regulatory wzrostu w celu ułatwienia regeneracji transformowanych komórek. Selekcję transformantów prowadzi się w obecności antybiotyku obecnego w pożywce hodowlanej. Transformowane rośliny analizuje się ostatecznie pod kątem stabilnej integracji i analizy funkcjonalnej wstawionego genu.

Protoplast Fusion:

Komórki bez ściany komórkowej określa się jako protoplasty. Te protoplasty mogą pobierać DNA bezpośrednio w obecności pewnych chemikaliów (takich jak glikol polietylenowy, PEG). Wyższe stężenie PEG powoduje permeabilizację błony komórkowej, co pozwala na pobieranie DNA do protoplastów. Nawet sygnały elektryczne mogą być używane do tworzenia małych otworów w membranie plazmowej przez przepuszczanie prądu elektrycznego.

Jest to znane jako elektroporacja. Te małe otwory pomagają w pobieraniu obcego DNA przez protoplasty. Następnie następuje tworzenie ściany komórkowej i inicjacja podziału komórki. Jednakże wytwarzanie roślin transgenicznych przez bezpośrednie przenoszenie genów do protoplastów zależy od wydajnego systemu regeneracji protoplastów do roślin.

Gene-gun lub Biolistic Gene Transfer:

Jest to najnowsza technika, w której można dostarczyć DNA będący przedmiotem zainteresowania do komórki przez ładowanie mikrocząstek (takich jak złoto lub wolfram) z dużą prędkością. Ten proces dostarczania DNA nazywa się bombardowaniem. Wewnątrz komórki cząsteczki DNA są uwalniane z cząsteczek i ostatecznie to DNA zostaje zintegrowane z jądrowym lub organicznym genomem komórki gospodarza.

Rośliny ex-tkankę są ostatecznie hodowane na pożywkach zawierających określone hormony / antybiotyki w celu selekcji transformowanych roślin. Gdy gen będący przedmiotem zainteresowania przenosi się do pożądanego gospodarza, należy ustalić jego stabilną integrację, którą przeprowadza się przez regenerację roślin. Osiąga się to dzięki technice hodowli tkankowej.

Proces hodowli tkankowej można podzielić na cztery etapy:

Etap I:

Obejmuje wybór odpowiednich eksplantatów i ich przeniesienie na pożywkę.

Etap II:

Obejmuje proliferację rosnącej tkanki na podłożu mnożącym.

Etap III:

Obejmuje przenoszenie rosnącej tkanki (kalusa) na nośnik, gdzie może różnicować się na różne części.

Etap IV:

Obejmuje przeniesienie roślinek do środowiska naturalnego. Jednakże, geny będące przedmiotem zainteresowania można dodać na dwa sposoby jako orientację sensowną i antysensowną. W celu ekspresji lub nadmiernej ekspresji genu można umieścić gen w orientacji sensownej. Jednakże, jeśli chce się zablokować niepożądany produkt lub etap biochemicznej ścieżki, można umieścić gen w orientacji antysensownej.