Test hydrolizy lipidów na bakteriach w celu ustalenia ich zdolności do hydrolizy lipidów (z rysunkiem)

Przeczytaj ten artykuł, aby zapoznać się z testem hydrolizy lipidów, aby dowiedzieć się, jak bakteria hydrolizuje lipidy (tłuszcze)!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność hydrolizowania lipidów (tłuszczów) do glicerolu i kwasów tłuszczowych, ponieważ posiadają one enzym lipolityczny "lipazę".

Bakterie te nazywane są bakteriami lipolitycznymi. Podczas gdy lipidy tworzą emulsję, gdy są dozowane na agarze, powodują nieprzezroczystość, ich zhydrolizowane produkty końcowe, glicerol i kwasy tłuszczowe, nie tworzą takiej emulsji z agarem, dla którego nie wytwarzają takiej nieprzezroczystości; raczej zapewniają przejrzystość.

W teście hydrolizy lipidów badane bakterie hoduje się na płytkach agarowych zawierających tributyrynę jako substrat lipidowy. Tributyrin tworzy emulsję, gdy jest dozowana na agarze, tworząc nieprzezroczysty ośrodek.

Jeśli bakterie mają zdolność hydrolizowania lipidów, ich kolonie hydrolizują tributyrynę w ośrodku w otaczających je obszarach do rozpuszczalnego glicerolu i kwasów tłuszczowych (kwas masłowy), podczas gdy reszta obszarów płytek zawiera niehydrolizowaną tributyrenę.

W wyniku tego wokół kolonii powstają przezroczyste, czyste strefy, ponieważ powstałe wokół nich hydrolizowane produkty, glicerol i kwasy tłuszczowe nie tworzą emulsji z agarem. Z drugiej strony, pozostałe obszary płytek pozostają nieprzezroczyste, ponieważ niehydrolizowana tributyryna w tych obszarach tworzy emulsję z agarem.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelka do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, saszetka utylizacyjna, inkubator, agar tributyrynowy, izolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Dwie szalki Petriego są czyszczone, przykrywane papierem ściernym i wiązane nicią lub gumką (rysunek 7.22). Ten krok, jak również sterylizacja szalek Petriego w etapie 6, pomija się, jeśli stosuje się bezpośrednio sterylizowane w piecu szalki Petriego.

2. Składniki pożywki z agarem tributyrynowym (z wyłączeniem tributyryny, która jest składnikiem lipidowym) lub jego gotowy proszek wymagany do napełnienia 100 ml pożywki, odważa się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml przez wytrząsanie i mieszając.

3. Wartość pH ustala się za pomocą papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 2 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

4. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

5. Po ochłodzeniu do około 90 ° C dodaje się tributyrynę i emulguje w mieszalniku Warring.

6. Kolba jest z bawełny, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

7. Dwie szalki Petriego i kolbę stożkową zawierającą agar z tributyryną sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut.

8. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez pewien czas, nie dopuszczając do zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

9. Aby przygotować płytki z agarem z tributyryną, zanim sterylizowana agarowa agarowa tributyryna ochłodzi się i zestala, w ciepłym stanie stopionym, jest ona wylewana aseptycznie, najlepiej w komorze laminarnej, do dwóch wysterylizowanych szalek Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione medium całkowicie pokrywa dno szalek Petriego.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Tributyryna tworzy emulsję, gdy jest wydawana na agarze, tworząc nieprzezroczysty ośrodek. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

10. Każda płytka jest oznaczona na dolnej stronie na cztery kwartały.

11. "Miejsce inokulacji" badanych bakterii odbywa się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze laminarnej, w centrum każdej ćwiartki, wykonując plamę (lub niewielką rozmaz) bakterii za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

12. Zaszczepione płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu, w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin w inkubatorze, aż do pojawienia się kolonii bakterii.