Top 3 Kolejne etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Poniższe punkty wskazują trzy najlepsze kolejne etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Kolejne kroki to: Denaturacja 2. Wyżarzanie 3. Rozszerzenie DNA.

Sekwencyjny Krok # 1. Denaturacja:

Pierwszym krokiem jest denaturacja DNA (zarówno DNA startera, jak i Natywnego DNA). Oddzielenie dwóch nici DNA jest znane jako denaturacja, podczas gdy połączenie dwóch drzewostanów jest zwane ponownie renaturacją lub hybrydyzacją (ryc. 48.1). Odkrycie denaturacji i ponownego wyżarzania DNA zostało dokonane sztucznie przez Marmora i Lane'a (1960).

Według nich dwuniciowy DNA można podzielić na dwie oddzielne pojedyncze nici (denaturujące) przez ogrzewanie w wysokiej temperaturze (90-95 ° C) i hybrydyzację lub połączenie dwóch nici DNA (dwuniciowego DNA), co jest możliwe dzięki obniżenie temperatury (50-56 ° C).

Jest to główna zasada działania PCR. Drugą zasadą jest przedłużenie startera za pomocą enzymu polimerazy DNA.

Natywny DNA, starter i enzym polimerazy DNA (polimeraza Tag) dodaje się do probówki PCR, a temperaturę podnosi się i obniża w maszynie do PCR w celu denaturacji i hybrydyzacji.

Sekwencyjny Krok # 2. Wyżarzanie:

Po denaturacji DNA, następnym etapem jest umożliwienie syntezy startera do hybrydyzacji z przeciwnymi niciami DNA pożądanej sekwencji docelowej. Wyżarzanie (hybrydyzacja) może wystąpić, gdy temperatura z 95 ° C zostanie obniżona do 50/56 ° C. Temperatura jest następnie obniżana w maszynie.

Gdy temperatura zostanie obniżona, nić nić DNA będzie wiązać się nie tylko nawzajem, ale także wiązać startery. Ta specyficzna hybrydyzacja lub "rekombinacja" komplementarnych nukleotydów zapewnia zarówno uzasadnienie, jak i praktyczną podstawę dla dużej części zrekombinowanego DNA (ryc. 48.2).

Sekwencyjny Krok # 3. Rozszerzenie DNA (potrzeba polimerazy polimerazy Taq):

Po wyżarzaniu starterów powinny one zostać przedłużone przy użyciu startera oligonukleotydowego jako punktu inicjacji. opisali, że polimeraza DNA enzymu jest niezbędna do syntezy DNA. Dlatego do przedłużenia startera potrzebujemy termostabilnej polimerazy DNA, aby enzym nie został zniszczony w wysokiej temperaturze.

Termostabilną polimerazę (polimerazę Taq) izoluje się z Thermus aquaticus. Polimeraza Taq ma ogromną zaletę w przeprowadzaniu reakcji PCR. Ma optymalną temperaturę działania około 70 ° C, a świeżego enzymu nie należy dodawać do każdej probówki po procesie ogrzewania i chłodzenia.

Termostabilna polimeraza DNA jest teraz wytwarzana przez różne firmy z różnych źródeł (innych niż Thermus aquaticus) pod różnymi nazwami handlowymi (TM). W celu przedłużenia startera dodaje się termo stabilną polimerazę DNA w rurce i temperaturę podnosi się do 65-70 ° C.

Kolejne cykle separacji nici (denaturacja), hybrydyzacji starterów (hybrydyzacja) i syntezy nici (rozszerzenie) zapewniają wykładniczą amplifikację docelowych sekwencji przy użyciu amplifikowanej sekwencji, jeśli poprzedni cykl jako nowy szablon, są trzy cykle (ryc. ).

Wytwarzanie podkładu:

Startery są krótką sekwencją (często RNA), aby utworzyć dwa nukleotydy, w odniesieniu do startera, z jednym na każdy koniec fragmentu DNA i zapewnia się wolny koniec 3 -OH, przy którym polimeraza DNA rozpoczyna syntezę łańcucha deoksyrybonukleotydowego.

Jedna sekwencja jest wykonywana w kierunku zmysłowym, a druga w kierunku antysemickim. (Rys. 48.2). Starter jest używany do przygotowania syntezy wolnych nici DNA i zaprojektowania takiego, że DNA między primerami jest fragmentem będącym przedmiotem zainteresowania, który ma być amplifikowany.

Jeśli matrycowy RNA (mRNA) jest amplifikowany, musi zostać przekształcony w komplementarny DNA (cDNA) przez zależną od RNA polimerazę DNA, odwrotną transkryptazę. Kompleks cDNA zostaje następnie przekształcony w dwuniciowy DNA, stając się matrycą dla kolejnej reakcji PCR.

Jest to często znane jako reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT PCR). Grunty można wytwarzać sztucznie lub można je nabyć od firm.

Po zakończeniu reakcji zamplifikowane produkty (DNA) można zwizualizować za pomocą elektroforezy żelowej. Ważną fizyczną właściwością cząsteczki DNA jest to, że każdy pojedynczy nukleotyd ma ładunek ujemny netto, wynikający z grupy fosforanowej.

Tak więc fragmenty o różnej wielkości wystawione na działanie pola elektrycznego mają skłonność do migrowania w kierunku elektrody dodatniej w różnym tempie w zależności od wielkości, przy czym małe fragmenty migrują szybciej niż większe. Ten proces separacji w oparciu o ładunek elektryczny nazywa się elektroforezą.

Próbki DNA, po strawieniu na fragmenty o różnych rozmiarach przez enzym restrykcyjny (endonukleazę), dodaje się do ośrodka nośnego, takiego jak żel agrozy lub akryloamid. Pory żelu zależą od jego zawartości procentowej i można je porównać do sita (molekularnego). Zatem prędkość migracji fragmentów DNA przez żel zależy zarówno od wielkości fragmentu DNA, jak i od zastosowanego napięcia.

Procedura oddzielania i dedukowania specyficznego fragmentu DNA to Southern blotting. Znaczenie tej techniki polega na tym, że fragment pojedynczej nici może być przenoszony przez działanie kapilarne na stałe podłoże nośne (nylon lub membrana celulozowa) i trwale utrwalony przez ogrzewanie (ryc. 48.3).

Po elektroforezie wzór DNA można wizualizować w lampie UV po traktowaniu bromkiem etydyny; bromek etydyny jest barwnikiem fluorescencyjnym. Elektroforeza w żelu agroseksowym rozróżnia fragmenty od 100 par zasad do 60000 par zasad (60 kb), podczas gdy żele poliakryloamidowe skutecznie oddzielają fragmenty niż 1000 par zasad (1 kb).

Pulsacyjna elektroforeza żelowa (PFGE) umożliwiła rozdział fragmentów DNA nawet do 2kb. W tej procedurze pole elektryczne zmienia się w różnych kierunkach, zmuszając cząsteczki DNA do reorientacji między każdym impulsem lub prądem elektrycznym. Jest to najlepsza technika do identyfikacji znanego genu.

Endonukleazy mogą rozpoznać 3, 4, 5, 6 lub 8 par zasad i są dostępne na rynku.

Bufory / sole PCR.

W przypadku polimerazy DNA Taq bufor wykonuje się jak poniżej:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCl w temperaturze pokojowej

Dimetylosulfotlenek (DMSO) i glikol są stosowane jako współrozpuszczalnik w buforach PCR, gdy cel ma bardzo wysoką temperaturę denaturacji.

Trójfosforan deoksynukleotydu (dNTP) to kofaktory jonowe.

Teraz firmy biotechnologiczne dostarczają gotowe rozwiązania.

Podstawowa zasada jest opisana w następujący sposób:

Istnieją cztery dNTP, mianowicie dATP (trifosforan adeniny), dCTP (cytozyna), dGTP (gunina), dUTP (uracyl), które są stosowane zgodnie z zasadami pary zasad w celu przedłużenia startera i ostatecznie skopiowania sekwencji docelowej.

DNTP wiąże się z Mg ²⁺ . Ilość dNTP obecnych w reakcji określi ilość wolnego Mg2 ⁺ dostępnego dla optymalnej aktywności enzymu. Roztwory dNTP w stanie wolnym należy zobojętnić za pomocą zasady Tris do pH 7, 0, a ich stężenie należy określić spektrofotometrycznie.

Analogi substratów i substratów:

Polimeraza Taq działa (dNTP) bardzo skutecznie. Jednak istnieją pewne zmodyfikowane substraty dostępne w miejsce substratu polimerazy DNA Tag. Są to doxxigenin-dNTP, biotyna-11-dUTP, C7deaza-dGTP i fluorescencyjnie znakowany dNTPS.

Następujące rodzaje PCR są w powszechnym użyciu:

(1) Zagnieżdżony PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Anchor PCR;

(4) Asymetryczny PCR;

(5) odwrotna PCR;

(6) DOP-PCR.