HLA: Metody testowania zgodności tkankowej

Histokompatybilność Metody testowania!

System HLA jest w dużym stopniu polimorficzny. Polimorficzna natura alleli HLA została początkowo znaleziona i zdefiniowana metodami serologicznymi, a antygenom HLA podano liczby. Później stwierdzono, że antygeny o tej samej swoistości serologicznej mogą mieć różne sekwencje aminokwasowe. Do roku 1999 liczba znanych alleli HLA przekroczyła 1000, a liczba wciąż rośnie. Ze względu na rozległy polimorfizm nomenklatura alleli HLA jest złożona, a także trudno jest zrozumieć tę nomenklaturę, chyba że dana osoba znajduje się w polu zgodności tkankowej.

Pierwszym zsekwencjonowanym allelom nadano nazwy z dwiema cyframi, które odpowiadały ich specyfice serologicznej. Po pierwszych dwóch cyfrach następują kolejne dwie cyfry wskazujące chronologiczny porządek nazewnictwa przez Komitet ds. Nomenklatury WHO dla Czynników systemu HLA. (Na przykład pierwszy allel zsekwencjonowany z genu HLA-A2 nazwano HLA-A 0201, a drugi sekwencjonowany allel nazwano HLA-A 0202.)

Pisanie HLA odbywa się metodami selekcji serologicznej lub metodami typowania molekularnego. Serologiczne metody typowania HLA wykrywają epitopy cząsteczek HLA, podczas gdy metody molekularne wykrywają sekwencje nukleotydowe.

ja. Typowanie HLA, które definiuje grupy alleli (zwykle zbliżone do specyficzności serologicznej) jest określane jako pisanie w niskiej rozdzielczości lub rodzajowe (na przykład HLA-DRBl-04).

ii. Wpisywanie, które rozwiązuje wszystkie znane allele, jest określane jako typowanie HLA o wysokiej rozdzielczości (na przykład HLA-DR BI x401).

iii. Pisanie, które ustępuje poza swoistość serologiczną, ale nie osiąga poziomu allelu, jest określane jako typowanie pośrednie (na przykład HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Program dawcy szpiku stworzył kod ułatwiający zarządzanie tymi złożonymi danymi o średniej rozdzielczości. W tym systemie nazwa HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / jest DRBl-04EJV.

Testowanie zgodności tkankowej metodami serologicznymi:

Limfocyty są używane do serologicznego typowania HLA, przesiewania przeciwciał i krzyżowego dopasowania.

Izolacja limfocytów dla HLA Typing:

ja. Krew żylną obwodową miesza się z Ficoll-Hypaque i odwirowuje. Warstwę zawierającą jednojądrzaste komórki krwi obwodowej odsysa się, przemywa i stosuje.

ii. Stosuje się limfocyty wyizolowane z węzłów chłonnych i śledziony zwłok.

iii. Pisanie HLA dla antygenów klasy II odbywa się za pomocą wzbogaconych populacji komórek B (Około 80 procent prawidłowych komórek T krwi obwodowej jest spoczynkowymi limfocytami T, które nie posiadają antygenów klasy II na ich powierzchni).

iv. Oporniki magnetyczne powlekane mAb anty-CD2 lub anty-CD3 są stosowane do izolowania komórek T; i magnetyczne perełki powlekane mAb anty-CD19 są stosowane do izolowania komórek B.

Wykrywanie antygenów HLA limfocytów:

Badanie mikotoksyczności jest zależnym od dopełniacza testem cytotoksyczności limfatycznej. Zamrożone tacki do pisania zawierające studzienki opłaszczone różnymi przeciwciałami przeciwko antygenom HLA są komercyjnie dostępne.

Około 2000 limfocytów jest dozowanych do każdego dołka na tacy i inkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej. (Przeciwciała w każdej studzience wiążą się ze specyficznymi antygenami HLA na powierzchni limfocytów, jeśli są obecne).

↓

Pięć μl dopełniacza (zazwyczaj surowica królika) dodaje się do każdej studzienki i inkubuje przez 60 minut (białka dopełniacza powodują śmierć limfocytów pokrytych mAb, przy braku wiązania mAb z limfocytami dopełniacz nie jest aktywowany i limfocyty nie są zabijane).

↓

Dodaje się barwnik eozyny Y, a następnie formaldehyd (formaldehyd stabilizuje reakcję).

↓

Następnie martwe komórki i żywe komórki w każdej studzience zlicza się pod mikroskopem z kontrastem fazowym.

ja. Obrzękłe i ciemne komórki są martwymi komórkami (barwnik eozyny Y wchodzi do martwych komórek).

ii. Jasne i załamujące światło komórki to żywe komórki (barwnik eozyny Y nie dostaje się do żywych komórek).

Każda studzienka na tacy jest oglądana indywidualnie dla martwych komórek i żywych komórek. Procent martwych komórek w każdej studzience jest obliczany, a ocena odbywa się zgodnie z Tabelą 27.5.

Tabela 27.5: Ocena wyników testu cytotoksyczności limfatycznej HLA:

Rodzaj HLA osobnika jest określany przez interpretację reakcji limfocytów pacjenta z różnymi surowicami odpornościowymi stosowanymi w teście cytotoksyczności limfocytów zależnych od dopełniacza.

ja. Oczekuje się, że każdy osobnik będzie miał dwa antygeny HLA-A, dwa HLA-B i dwa antygeny HLA-C na powierzchni limfocytów.

ii. Jeśli dana osoba wykazuje w teście tylko jeden antygen HLA-A lub HLA-B lub HLA-C, prawdopodobnie ten osobnik jest homozygotyczny pod względem tego konkretnego antygenu lub panel antysurowic użyty w teście nie ma swoistego przeciwciała przeciw drugiemu antygenem lub występuje niska ekspresja cząsteczek HLA na powierzchni limfocytów.

Testy cytotoksyczności limfocytów zależne od dopełniacza dla antygenów HLA-DR i HLA-DQ przeprowadza się przy użyciu komórek B izolowanych przez powlekane perełki magnetyczne MAB lub limfocyty B izolowane na wełnie nylonowej.

Większość surowic do typowania HLA pochodzi od wielu kobiet. Ponieważ mutoparyczne kobiety są wielokrotnie eksponowane na antygeny HLA płodów, surowice wielu kobiet mają przeciwciała przeciwko antygenom HLA. Prawie 200 różnych antysurowic stosuje się do oznaczania indywidualnych antygenów HLA.

Początkowo sądzono, że można opracować mAb dla każdego z antygenów HLA, a pisanie HLA byłoby proste. Ale wiele mAb wiąże się raczej z typowymi epitopami niż z prywatnymi epitopami antygenów HLA. Ponadto wiele mysich mAb nie utrwala dopełniacza (a zatem ich zastosowanie w testach cytotoksyczności limfocytów zależnych od dopełniacza jest ograniczone).

Jednak mysie mAb można stosować w metodzie ELISA i metodzie cytometrii przepływowej, które nie wymagają dopełniacza. Ostatnio wiele laboratoriów preferuje raczej typowanie molekularne HLA niż serologiczne typowanie HLA.

Badanie przesiewowe surowicy od biorcy przeszczepu na przeciwciała przeciwko antygenom l-ILA (badanie przesiewowe przeciwciał):

Obecność przeciwciał przeciwko antygenom HLA w surowicy biorcy przeszczepionego narządu oczekującego jest zwykle wykonywana przez cytotoksyczność limfocytów zależną od dopełniacza. Limfocyty ze znanymi antygenami HLA i dopełniaczem są zmieszane z surowicą biorcy. Po odpowiedniej inkubacji liczy się martwe limfocyty i żywe limfocyty. Procentowo reaktywne przeciwciało (PRA) jest następnie obliczane.

PRA = Liczba pozytywnych komórek / Liczba wszystkich komórek panelu x 100

PRA wskazuje na stopień uwrażliwienia osoby oczekującej na antygeny HLA.

Metoda ELISA do przeszukiwania przeciwciał HLA surowicy:

Metoda ELISA jest łatwa, szybka i nie wymaga obecności żywych limfocytów ani uzupełnienia. Antygeny HLA oczyszczone na podstawie powinowactwa są powlekane na ściankach płytki mikrotitracyjnej

↓

Dodaje się surowicę od biorcy i inkubuje

↓

Po przemyciu dodaje się skoniugowane z enzymem przeciwludzkie IgG i inkubuje.

↓

Po przemyciu dodaje się substrat i inkubuje.

ja. Rozwój koloru w konkretnej studzience wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko antygenowi HLA pokrytemu w tej studzience.

ii. Brak rozwoju barwy w konkretnym dołku wskazuje na brak przeciwciał przeciwko konkretnemu antygenowi HLA pokrytemu na tej studzience.

Cytometr przepływowy do wykrywania przeciwciał HLA w surowicy:

Mikrokulki pokryte antygenami HLA inkubuje się z surowicą pacjenta, a następnie z przeciwciałami przeciw-ludzkim IgG znakowanymi fluorescencyjnie. Procent perełek, które barwią się powyżej tła, zapewnia pomiar procentowych przeciwciał reagujących z panelem pacjenta (PRA).

Dopasowanie krzyżowe:

Jeśli krew odbiorcy czekającego zawiera przeciwciała przeciwko antygenom HLA dawcy, antygeny HLA w komórkach dawcy zostaną zaatakowane przez przeciwciała biorcy po transplantacji. Dlatego przed przeszczepem ważne jest, aby wiedzieć, czy biorca ma przeciwciała przeciwko antygenom HLA dawcy.

Jeśli przeciwciała swoiste dla antygenu HLA dawcy są obecne w surowicy biorcy, przeszczep zostanie odrzucony. Przeprowadzono krzyżowe dopasowanie w celu wykrycia obecności przeciwciał surowicy osoby oczekującej wobec proponowanych antygenów donora HLA.

Cytotoksyczność limfatyczna Dopasowanie krzyżowe do limfocytów krwi obwodowej:

Limfocyty krwi obwodowej proponowanego dawcy (które w przybliżeniu zawierają 80 procent komórek T (które niosą antygeny MHC klasy I) i 20 procent komórek B i monocytów (które posiadają antygeny MHC klasy I i klasy II) miesza się z surowicą czekającego biorcy i inkubuje .

↓

Uzupełnienie dodaje się i inkubuje.

↓

Dodaje się barwnik eozyny Y i inkubuje.

ja. Liczbę martwych i żywotnych komórek zliczono i obliczono procent martwych komórek. 50 procent lub więcej śmierci komórki wskazuje na silne pozytywne dopasowanie krzyżowe (tj. Surowica biorcy ma przeciwciała zdolne do reagowania z antygenami HLA dawcy). Silne pozytywne dopasowanie między biorcą a proponowanym dawcą jest przeciwwskazaniem do przeszczepu narządu od dawcy do biorcy.

Aby ustalić, czy przeciwciała biorcy są skierowane przeciwko antygenom klasy I lub klasy II, przeprowadza się odpowiednio krzyżową analizę limfatyczną limfocytów T (przy użyciu wzbogaconych komórek T) lub cytotoksyczność limfocytów B ("za pomocą wzbogaconych komórek B").

Dopasowanie krzyżowe cytometru przepływowego jest 30-250 razy bardziej czułe niż wizualne serologiczne metody wykrywania przeciwciał IgG przeciwko antygenom HLA na powierzchni limfocytów.

Limfocyty krwi obwodowej proponowanego dawcy inkubuje się z znakowanymi (np. Barwnikiem fluorescencyjnym emitującym zielone światło) mAb anty-CD3, które wiążą się z limfocytami T.

↓

Znakowane limfocyty T związane z anty-CD3 są oddzielane od komórek B w cytometrze przepływowym.

↓

Oddzielone, zabarwione komórki T są teraz inkubowane z serum oczekującego biorcy.

ja. Przeciwciała surowicy od biorcy przeciw antygenom HLA komórek T dawcy, jeśli są obecne, będą wiązać się z komórkami T.

↓

Po przemyciu dodaje się flurochrom (który emituje znakowany anty-ludzką IgG inny niż zielony, powiedzmy kolor czerwony) i inkubuje.

ii. Znakowane florochromem antyludzkie IgG będzie wiązało się z przeciwciałami HLA biorcy, które są związane z komórkami T dawcy.

Cytometr przepływowy zlicza liczbę limfocytów T (kolor czerwony i zielony) oraz limfocytów T (kolor zielony) i tworzy histogram.

Dopasowanie krzyżowe dla autoprzeciwciał przeciwko limfocytom:

Podczas meczu krzyżowego autoprzeciwciała przeciwko limfocytom w surowicy biorcy mogą wiązać się niespecyficznie z limfocytami dawcy i dać wynik fałszywie dodatniego wyniku krzyżowego; iw konsekwencji dawcy zostaje błędnie zdyskwalifikowany z organu dawcy na konkretnego biorcę. Autoprzeciwciała mogą również maskować obecność specyficznych przeciwciał przeciwko dawcy.

Obecność autoprzeciwciał na limfocytach jest wykrywana przez auto-dopasowanie, w którym limfocyty i surowica biorcy są łączone w standardowym teście cytotoksyczności. Mecze krzyżowe autoprzeciwciał są rutynowo wykonywane w połączeniu ze wszystkimi meczami krzyżowymi żywych dawców dla każdej badanej surowicy.

Metody biologii molekularnej dla typowania HLA:

Większość metod typowania molekularnego wykorzystuje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do selektywnej amplifikacji segmentów genów HLA wymaganych do pisania.

Sekwencyjne typowanie wstępne (SSP):

DNA osobnika ekstrahuje się z komórek lub tkanek

↓

DNA jest dodawane do probówek zawierających różne zestawy starterów dla różnych genów HLA. Dodatkowy zestaw starterów jest włączony jako dodatnia kontrola amplifikacji we wszystkich probówkach.

`↓

Inne składniki reakcji PCR (takie jak nukleotydy DNA, polimeraza DNA, bufor) dodaje się i przeprowadza się cykle cieplne.

↓

Amplifikowane produkty poddano elektroforezie w żelu bromkiem etydium i sfotografowano w świetle UV.

ja. Obecność prążka wskazuje, że próbka DNA ma sekwencję odpowiadającą konkretnemu typowi HLA.

ii. Brak pasma wskazuje, że próbka DNA nie zawiera określonej sekwencji typu HLA.

iii. Wewnętrzny pas kontrolny amplifikacji powinien być obecny do interpretacji.

Zestawy starterów do typowania HLA są komercyjnie dostępne.

ja. W przypadku HLA-A, B i C wymagane jest wpisanie około 100-200 reakcji.

ii. W przypadku HLA-DRB wymagane jest wpisanie około 20-30 reakcji.

Hybrydyzacja sondy oligonukleotydowej specyficznej dla sekwencji (SSOP):

Metoda SSOP obejmuje selektywną amplifikację celu HLA, a następnie hybrydyzację z panelem sond oligonukleotydowych. Istnieją dwa formaty SSOP.

ja. Dot lub slot blot:

Zamplifikowane DNA wiąże się ze stałym nośnikiem (takim jak membrana nylonowa), a sonda hybrydyzacyjna znajduje się w roztworze.

ii. Odwrotna kropka lub slot blot:

Sonda jest związana z podłożem stałym i hybrydyzowana ze zamplifikowanym DNA w roztworze.