Biologia molekularna w hodowli ryb (z wykresem)

W tym artykule omówimy biologię molekularną w hodowli ryb.

Odkrycie technologii rekombinacji DNA stało się rewolucją we współczesnej biologii molekularnej. Dzięki tej technice, duże ilości białek obecnych w ilości śladowej, jak również inne substancje biologicznie czynne, mogą być generowane przez biotechnologię i te genetycznie modyfikowane makrocząsteczki mają bardzo małe skutki uboczne.

Może być również stosowany do wykonywania diagnostycznej hybrydyzacji in situ. Technika ta pomaga również izolować i identyfikować geny odpowiedzialne za choroby dziedziczne.

W 1983 r. Rekombinacyjnie wytworzony aktywator plazminogenu (rt PA) dokonał paradygmatycznego przesunięcia w terapii zawału mięśnia sercowego (atak serca). Teraz przy użyciu technologii rekombinacji DNA na rynku znajduje się wiele innych produktów, takich jak hirudyna, dysmutaza ponadtlenkowa, urokinaza, prokinaza itp.

W akwakulturze, szczególnie w hodowli indukowanej, stosuje się surowe przysadki piscjan i ssaków. Ekstrakt z przysadki zawiera hormony wzrostu gonadotropiny i ich czynniki uwalniające. Są one wymagane w nadmiarze do hodowli ryb.

Te polipeptydy są zbyt duże, aby można je było syntetyzować chemicznie, a te polipeptydy mogą być generowane biotechnologicznie poprzez manipulację DNA, będą miały najmniej skutków ubocznych i będą lepsze zamiast syntetycznie przygotowanych analogów już stosowanych do masowej hodowli.

Niedawno osiągnięto sukces w hodowli ryb w poprawianiu wielu cech ilościowych, takich jak średnica jaj, tempo wzrostu masy ciała, długość ciała i hiper-odporność w rybach, takich jak Tilapia zillii i Oreochromis niloticus, po prostu przez wstrzyknięcie DNA Shark do mięśni za pomocą strzykawki.

Analiza metodą losowego zamplifikowanego polimorficznego DNA (RAPD) wykazała, że ​​polimorficzne fragmenty wahały się między 54, 55% dla startera 1 (5'-ACC GGG AACG - 3 ') a 14, 29% dla startera 2 (5'-ATGACCTTGA-3'), jak donosił Sudha. i wsp., 2001, El-Zaeem & Assem, 2004 i Assem 2 EL-Zaeem, 2005.

Białka rybne są obecnie stosowane również w medycynie. Protaminę stosuje się w celu odwrócenia działania przeciwzakrzepowego podczas operacji kardiochirurgicznej i cewnikowania. Kalcytonina łososiowa jest lepsza od kalcytoniny ssaczej w leczeniu choroby Pageta i pewnej postaci osteoporozy. Białko przeciw zamarzaniu ryby stosuje się w krioprezerwacji narządów ludzkich, a także w konserwowaniu żywności.

Hodowla komórek i technologia rekombinacji DNA u ryb są powolne i wymagają bardziej obszernych badań. Jednak geny ryb dla niektórych potencjalnych produktów zostały wyrażone w bakteriach i drożdżach. W komórkach drobnoustrojów badano produkcję kalcytoniny łososiowej i białek przeciw zamarzaniu.

Istnieje ogromna potrzeba uzyskania genu lub mRNA dla polipeptydu, takich jak hormony wzrostu gonadotropiny ryb, cytokininy, protaminy, kalcytoniny i białka przeciw zamarzaniu itp. Po zsyntetyzowaniu genu / mRNA, można go przekształcić w cDNA przez enzym odwrotną transkryptazę. .

Po uzyskaniu cDNA dla konkretnego białka, następnie poprzez klonowanie DNA (technika stosowana do produkcji dużych ilości specyficznego fragmentu DNA w celu wytworzenia milionów kopii fragmentu DNA rutynowymi technikami klonowania bakterii) można uzyskać dużą ilość DNA.

Fragment DNA będący przedmiotem naszego zainteresowania może zostać wprowadzony lub wstawiony do plazmidu (obecnego jako samoskładające się ciała pozakososomalne) w bakteriach lub wirusach (replikacja w bakteriach, bakteriofagach) lub sztucznie opracowanych wektorach zwanych kosmidami.

Do wstawienia DNA wektora jest cięty przez endonukleazy, a następnie wstawiany jest cDNA i ostatecznie łączony przez enzymy znane jako ligazy DNA. Produkt zawiera teraz fragment DNA w DNA wektora, stąd technika jest znana jako rekombinowany DNA. Wektor ten jest następnie amplifikowany w odpowiednim gospodarzu albo w hodowli bakteryjnej, komórkowej ssaków albo w hodowli komórkowej.

Rozmiar klonowania jest ograniczony. Plazmid może pomieścić 15000 bp, fagów do 25000 bp i kosmidów do 45000 bp. Rozmiar został pokonany przez technikę znaną jako sztuczne chromosomy drożdży (YAC).

Watson i Crick (1953) opisali DNA jako strukturę dwuniciowej helisy (ryc. 38.1). DNA jest cząsteczką polinukleotydową. Nukleotydy są połączone ze sobą za pomocą wiązania fosfodiestrowego. Ma ogromny rozmiar, a każdy chromosom jest ciągłą cząsteczką DNA. Cząsteczka składa się z zasady, dezoksyrybozy i fosforanu. Informacja genetyczna odziedziczona przez osobnika jest kodowana w DNA.

Dwa łańcuchy DNA, jeden to 5'-3 ', a drugi to 3'-5' w kierunkach, tj. Dwa łańcuchy są sobie przeciwne. Kierunek jest ważny, ponieważ replikacja DNA rozpoczyna się od 5 'do 3', a także sekwencja niezbędna do regulacji genów znajduje się na końcu 5 'do 3' genu. Parowanie wodoru między zasadami jest specyficzne, adenina (A) zawsze paruje z tyminą (T), a guanina (G) zawsze paruje z cytozyną w DNA.

DNA ma jeszcze jedną cechę charakterystyczną, że te dwie nici można oddzielić, jeśli temperatura podniesie się do 95 ° C, jest to znane jako denaturacja. Te dwie oddzielone nici można połączyć, tworząc oryginalną strukturę, jeśli temperatura zostanie obniżona do 55 ° C, zjawisko to jest znane jako hybrydyzacja lub hybrydyzacja. Ta charakterystyczna cecha jest ważniejsza dla technologii rekombinacji DNA.

Centralnym dogmatem biologii molekularnej jest to, że DNA daje początek mRNA przy użyciu DNA jako matrycy. Proces ten jest znany jako transkrypcja. MRNA odpowiada za powstawanie białka, zjawisko znane jako translacja, a synteza białka jest funkcją komórki (ryc. 38.2).

Tworzenie mRNA jest skomplikowane, podczas dojrzewania mRNA introny są splicowane, a egzonie są przegrupowywane. MRNA wychodzi z jądra i koduje specyficzne białko. Przed wejściem do cytoplazmy mRNA tworzy zmetylowany kapsel z końcem 5 'i ogon poli (A) na końcu 3'. Nasadka jest niezbędna w inicjacji translacji, a ogon poli A w regionie 3 'jest istotny dla wiadomości w cytoplazmie (ryc. 38.3).

Przełom w biologii molekularnej ustalony, gdy odkryto go w retrowirusie, RNA można przekształcić w DNA przez enzym odwrotną transkryptazę. Odkrycie jest szkieletem rekombinacji. Technologia DNA. MRNA można przekształcić w cDNA (komplementarny DNA) za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy (Ryc. 38.4).

Innymi słowy, możliwe jest tłumaczenie mRNA na komplementarny DNA (cDNA) przy użyciu mRNA jako matrycy. Tak utworzony cDNA zawiera odpowiednie komplementarne zasady dla mRNA z wyjątkiem, oczywiście, tyminy zastępującej uracyl. CDNA otrzymany z mRNA jest obecnie stosowany w diagnostyce wielu chorób poprzez znakowanie radioaktywnym.

Odwrotna transkryptaza pomaga również w klonowaniu genu. Pierwszy gen został sklonowany w Stanford i powstała wówczas pierwsza cząsteczka technologii rekombinacji DNA, rewolucja w biologii molekularnej. Odkrycie endonukleaz lub enzymów restrykcyjnych pomaga w cięciu DNA do 3 do 8 nukleotydów.

Endonukleazy otrzymano z około 400 szczepów bakterii i te enzymy mogą rozpoznać około 100 różnych miejsc w DNA. Niektóre z endonukleaz, a także ich miejsca rozpoznawania (rys. 38.5).

Ryc. 38.5 Substrat zaatakowany przez endonukleazy restrykcyjne to sekwencja palandromowa. Palandromic czyta to samo z kierunków do przodu i do tyłu, np. MADAM. Najlepszym przykładem ograniczonego enzymu jest EcoR1 wytworzony ze szczepu E. coli Ry 13. EcoR1 atakuje sekwencję nukleotydową GAATTC, CTTAAG.

Ligazy DNA pomagają w łączeniu wstawki w DNA wektora, a wektor z oryginalnym i insercyjnym DNA może być amplifikowany w odpowiednim gospodarzu. Sanger i Coulson (1975) oraz Maxim i Gilbert (1977) opracowali techniki szybkiego sekwencjonowania DNA i RNA. Teraz dostępna jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która może dostarczyć 1 000 000 kopii fragmentu DNA w 3 do 4 godzin i miliard kopii w ciągu 24 godzin.

Za pomocą tych technik można poprawić akwakulturę, a białka ryb można uczynić biotechnologicznie. Dlatego szeroko zakrojone badania w tych liniach są niezbędne do ekspresji genów, zarówno w bakteriach, wirusach, jak i hodowlach komórek rybich.