Western Blotting of Proteins

Western blotting białek!

Białka denaturuje się przez inkubację z detergentem jonowym (SDS: dodecylosiarczan sodu) w temperaturze 100 ° C.

SDS jednolicie powleka wszystkie białka i sprawia, że ​​ładunek powierzchniowy białek jest ujemny.

↓

Denaturowane białko jest następnie poddawane elektroforezie w żelu poliakryloamidowym. Białka są rozdzielane jako odrębne prążki w zależności od ich ciężaru cząsteczkowego.

↓

Rozdzielone białka są elektroforetycznie przenoszone na bibułę filtracyjną (nylon lub nitrocelulozę).

↓

Bibułka filtracyjna jest następnie inkubowana z surowicą odpornościową przeciw białkom. Przeciwciała wiążą się z odpowiadającymi im antygenami białkowymi na bibule filtracyjnej i tworzą kompleksy antygen-przeciwciało.

↓

Bibułę filtracyjną przemywa się w celu usunięcia niezwiązanych składników surowicy.

↓

Znakowana enzymem anty-immunoglobulina (znana jako koniugat) jest dodawana do bibuły filtracyjnej i inkubowana.

↓

Koniugat wiąże się z przeciwciałem w kompleksie antygen-przeciwciało w bibule filtracyjnej.

↓

Bibułę filtracyjną przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu i dodaje się substrat i inkubuje.

ja. Kolorowe prążki rozwijają się w miejscach, w których występują kompleksy antygen-przeciwciało.

iii. Brak rozwoju pasma sugeruje, że odpowiednie przeciwciało przeciw antygenowi nie występuje w badanej surowicy.

Papiery filtracyjne impregnowane antygenami mogą być przechowywane przez dłuższy czas.

Test Western blot jest szeroko stosowany do wykrywania przeciwciał wirusa zapalenia wątroby typu C i jako test potwierdzający do wykrywania przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV).

Firmy handlowe impregnują papiery filtracyjne z oddzielonymi antygenami HIV i dostarczają je do laboratoriów. W laboratorium surowica pacjenta jest dodawana do bibuły filtracyjnej i przetwarzana w celu wykrycia obecności przeciwciał specyficznych względem HIV w surowicy.

Test radioimmunologiczny:

Radioimmunoassay (RIA) został opracowany przez Rosalin Yalow i Berson (1959). Wprowadzono wiele odmian metody. Istnieją dwie główne techniki RIA, konkurencyjna RIA i niekompetycyjna RIA.

Jako etykiety stosowane są różne radioizotopy (tabela 27.4), a emisje radioaktywne mierzone są w kategoriach zliczeń na minutę (CPM) za pomocą licznika scyntylacyjnego. Najpopularniejsza etykieta, ¹²⁵ I, wymaga krótszego czasu na zliczanie sygnałów, ale ma ograniczony okres trwałości ze względu na krótki okres półtrwania. Radioizotop trytu ( ³ H) wymaga dłuższego czasu do zliczania, a zatem całkowity czas testu jest zwiększony.

Zalety OSR to:

ja. Precyzja i wysoka jakość

ii. Koniugacja izotopów jest łatwa

iii. Wykrywanie sygnału bez optymalizacji

Tabela 27.4: Właściwości radioizotopów stosowanych w teście radioimmunologicznym:

Jednak RIA ma następujące wady

ja. Krótki okres półtrwania odczynników

ii. Zagrożenia radioaktywne.