Zwierzęta transgeniczne: Cele transferu genów z różnymi metodami transfekcji

Zwierzęta transgeniczne: Cele transferu genów przy różnych metodach transfekcji!

Transgeniczne zwierzę zawiera w swoim genomie gen lub geny wprowadzone przez jedną lub drugą technikę transfekcji.

Gen wprowadzony przez transfekcję nazywa się transgenem. U zwierząt transfekcja określa wprowadzenie segmentu DNA, nagiego lub zintegrowanego do wektora, do komórki zwierzęcej.

Cele transferu genów:

1. Modyfikacja genetyczna zwierząt może mieć na celu poprawę ich produkcji mleka, mięsa, wełny itp.

2. Geny zostały przeniesione na zwierzęta w celu uzyskania produkcji białek kodowanych przez te geny na dużą skalę w mleku, moczu lub krwi tych zwierząt.

3. Szczególny przypadek przenoszenia genów ma na celu złagodzenie lub nawet wyeliminowanie objawów i wynikających z tego niedoli chorób genetycznych. W tym podejściu do pacjenta wprowadza się normalne i funkcjonalne kopie wadliwego genu (terapia genowa).

4. Specyficzne transgeniczne szczepy zwierząt lub linie są tworzone w celu spełnienia specjalistycznych potrzeb doświadczalnych i / lub biomedycznych.

Metody transfekcji:

Zastosowano kilka metod wprowadzania DNA do komórek zwierzęcych / zarodków, które są następujące:

(i) Strącanie fosforanem wapnia.

(ii) Bezpośrednie mikroiniekcja.

(iii) Infekcja retrowirusami.

(iv) Lipofection.

(v) Dostawa pistoletu cząsteczkowego i

(vi) Electropoiation.

Opad fosforanu wapnia:

W tym podejściu preparat DNA do zastosowania do transfekcji najpierw rozpuszcza się w buforze fosforanowym. Roztwór chlorku wapnia dodaje się następnie do roztworu DNA; prowadzi to do powstania nierozpuszczalnego fosforanu wapnia, który współtrąca się z DNA. Osad fosforanu wapnia-DNA dodaje się do transfekowanych komórek.

Cząstki osadu są pobierane przez komórki przez fagocytozę. Początkowo 1-2% komórek było transfekowanych tym sposobem. Ale procedura została zmodyfikowana w celu uzyskania transfekcji do 20% komórek. W niewielkiej części transfekowanych komórek DNA zostaje zintegrowane z genomem komórki, wytwarzając stabilną lub trwałą transfekcję.

To ogólne podejście można zastosować do praktycznie wszystkich komórek ssaczych, a bardzo dużą liczbę komórek można leczyć przy niewielkim wysiłku. Ale wiele linii komórkowych nie lubi osadu fosforanu wapnia przylegającego do ich powierzchni lub do ich podłoża.

Lipofection:

Dostarczanie DNA do komórek przy użyciu liposomów nazywa się lipofekcją. Liposomy są małymi pęcherzykami wytworzonymi z odpowiedniego lipidu. Początkowo do wytwarzania liposomów stosowano niejonowe lipidy, tak że DNA musiał być wprowadzony do pęcherzyków po specyficznych procedurach kapsułkowania.

Zastosowanie kationowych lipidów do budowy liposomów jest wyraźną zaletą, ponieważ DNA spontanicznie i wydajnie kompleksuje się z tymi liposomami, co czyni niepotrzebne procedury enkapsydacji. Kationowe liposomy mają pojedynczą membranę dwuwarstwową lipidową (jednowarstwową) i skutecznie wiążą się z komórkami. Prawdopodobnie łączą się one z błoną plazmatyczną iw ten sposób dostarczają DNA (skompleksowane z nimi) do komórek, co powoduje transfekcję.

Lipofekcja jest metodą z wyboru do transfekcji komórek ssaków in vitro. Został również wykorzystany do dostarczania DNA żywym zwierzętom poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie lub wstrzyknięcie dożylne. Kationowe liposomy były stosowane w zastrzykach dożylnych lub dotchawiczych u myszy do ekspresji genów markerowych w płucach. Ukierunkowane dostarczanie zostało również wykazane przez włączenie specyficznych białek ligandowych do błon liposomowych.

Zakażenie retrowirusowe:

Rekombinowane retrowirusy wytwarzają wiriony, które są stosowane do infekowania komórek zwierzęcych i zarodków myszy. Genom RNA rekombinowanego retrowirusa jest kopiowany przez odwrotną transkryptazę, aby uzyskać kopię DNA (transkrypcję przychodów), która zostaje zintegrowana z genomem komórki. Odwrotna transkryptaza jest kodowana przez retrowirusa i jest wytwarzana natychmiast po infekcji.

Jednak odwrotna transkrypcja może zachodzić tylko w tych komórkach, które przechodzą przez fazę S, tj. Są mitotycznie aktywne. Kopia DNA rekombinowanego retrowirusa integruje się z genomem komórkowym w miejscach losowych i zwykle nie towarzyszy jej delecja lub rearanżacja.

Mikrowstrzykiwanie:

W tej metodzie roztwór DNA wstrzykuje się bezpośrednio do jądra komórki lub do męskiego przedjądrza zapłodnionej komórki jajowej o dwóch komórkach. Zazwyczaj zespół mikroiniekcji składa się ze stereoskopowego mikroskopu stereoskopowego o niskiej mocy (w celu obejrzenia komórki jajowej i całego procesu) oraz dwóch mikromanipulatorów, jednego dla mikropipety szklanej w celu utrzymania komórki jajowej przez częściowe zasysanie, a drugiego dla igły do ​​wstrzykiwania szkła, aby wprowadzić DNA do męskiego przedjądrza. Męski przedjądrza jest znacznie większy niż przedimek żeński zapłodnionych komórek jajowych ssaków. Jednak w komórkach jajowych ryb DNA jest wstrzykiwane do cytoplazmy jaj.

Ogólna procedura mikroiniekcji jest następująca: Samice-dawcy są indukowane do super-owulacji z zastosowaniem odpowiednich terapii hormonalnych. Przerobione samice są następnie łączone z płodnymi samcami, a duża liczba zapłodnionych jedno lub dwukomórkowych komórek jajowych / zarodków jest pobierana chirurgicznie. Ewentualnie zapłodnione komórki jajowe pobiera się od samic owulowanych; komórki jajowe są następnie zapładniane in vitro. Konstrukt transgenu wytwarza się w roztworze buforowym i wstrzykuje się go do pręcików męskich zapłodnionych komórek jajowych za pomocą zestawu do mikroiniekcji.