Replikacja DNA: Uwagi dotyczące replikacji, naprawy i rekombinacji DNA

Uwagi na temat replikacji, naprawy i rekombinacji DNA!

Replikacja DNA:

Półkonserwatywna replikacja DNA:

Replikacja DNA jest autokatalityczną funkcją DNA. Zwykle występuje w fazie S cyklu komórkowego, gdy chromosomy są w bardzo rozszerzonej formie. Zgodnie z propozycją Watsona i Cricka, replikacja DNA jest częściowo konserwatywna.

W semi-konserwatywnej replikacji dwie nici oddzieliłyby się od siebie, zachowały swoją integralność, a każda z nich zsyntetyzuje, z puli nukleotydów, jej komplementarną nić. Rezultatem byłoby, że nowo syntetyzowana cząsteczka będzie nosić lub konserwować jedną z dwóch nici z cząsteczki rodzicielskiej, a druga nić zostanie nowo złożona. Istnieją wystarczające dowody, aby udowodnić, że dwuniciowe DNA rzeczywiście replikuje się metodą pół konserwatywną.

Meselson i Stahl's Experiment (1958):

Pracownicy ci hodowali Escherichia coli w pożywce zawierającej ¹⁵ N izotopów. Po tym, jak replikowały się na kilka pokoleń w tej pożywce, oba nici tego DNA zawierały ¹⁵ N jako składniki puryn i pirymidyn. Gdy te bakterie z ¹⁵ N przeniesiono do pożywki hodowlanej zawierającej ¹⁴ N, okazało się, że DNA oddzielone od świeżego pokolenia bakterii ma jedną nić cięższą od drugiej.

Cięższa nić reprezentuje nić rodzicielską, a jaśniejsza jest nowa syntetyzowana z pożywki hodowlanej, co wskazuje na semi-konserwatywną metodę replikacji DNA i wykluczając zarówno zachowawcze, jak i dyspersyjne modele syntezy i replikacji DNA.

Konserwatywna replikacja nie wytworzyłaby żadnych cząsteczek DNA o "hybrydowej" budowie. Jeśli replikacja byłaby dyspersyjna, nastąpiłoby przesunięcie DNA z "ciężkiego w kierunku światła" przez każde pokolenie.

Późniejsze badania zweryfikowały konkluzję Meselsona i Stahla, że ​​replikacja DNA jest semi konserwatywna i rozszerzyła ją na wiele innych organizmów, w tym wyższe rośliny i zwierzęta.

Cairn's autoradiography experiment:

Użył radioaktywnej tyminy lub trytowanej tymidyny. Przez hodowanie E. coli w pożywce zawierającej trytowaną tymidynę, radioaktywność włączono do cząsteczek DNA potomnego.

W autoradiografie powielona cząsteczka DNA pokazuje widelec replikujący, punkt, w którym dwa łańcuchy stają się cztery. Po pierwszej replikacji, promieniotwórczość jest widoczna tylko w jednej z nici DNA i obie nici są znakowane po drugiej replikacji. Wspiera to semi-konserwatywne tryby replikacji DNA.

Eksperymenty JH Taylora na wierzchołkach korzeni Viciafaba (1957) również potwierdzają pół konserwatywną metodę replikacji DNA.

ja. Nieciągła replikacja DNA:

Okazaki zasugerował, że synteza DNA przebiega jednocześnie na obu niciach DNA wykorzystujących tę samą enzymatyczną polimerazę DNA w postaci małych wyizolowanych fragmentów. Te segmenty są znane jako kawałki Okazaki i składają się z 1000-2000 nukleotydów. Są one połączone przez enzym ligazę polinukleotydową, dopełniając tworzenie łańcucha polinukleotydowego.

Nieciągła synteza DNA jest wspierana przez eksperyment auto-radiograficzny.

ii. Jednokierunkowa i dwukierunkowa replikacja DNA:

J. Cairns z jego eksperymentów wywnioskował, że synteza DNA rozpoczyna się w ustalonym punkcie chromosomów i przebiega w jednym kierunku, ale ostatnie eksperymenty sugerują dwukierunkową replikację.

Levinthal i Cairns zaproponowali, aby podczas replikacji dwie nici nie rozdzieliły się całkowicie przed replikacją. Zamiast tego zaczynają rozpakowywać na jednym końcu i jednocześnie rozpakowane segmenty zaczynają przyciągać swoje pary nukleotydowe. W ten sposób rozpakowywanie oryginalnych nici DNA i synteza świeżych nici DNA idą obok siebie.

Polimerazy DNA:

Polimeraza DNA jest głównym enzymem replikacji DNA. Jego aktywność została po raz pierwszy wykazana przez Kornberga w 1956 roku. Katalizuje kowalencyjny dodatek dezoksyrybonukleotydów do 3'-OH wcześniej istniejącego nukleotydu zwanego starterem.

Enzym polimeraza-1 DNA jest obecnie uważany raczej za enzym naprawczy DNA niż przez enzym replikacyjny. Wiadomo, że ten enzym ma pięć miejsc aktywnych, mianowicie miejsce matrycy, miejsce startera, miejsce cięcia 5 '-> 3' lub miejsce egzonukleazy, miejsce trifosforanu nukleozydu i miejsce rozszczepienia 3 '-> 5' (lub miejsce egzonukleazy 3 '-> 5'). ).

Polimeraza DNA I:

Głównie bierze udział w usuwaniu starterów RNA z Okazaki lub fragmentów prekursorów i wypełniania powstałych szczelin dzięki zdolności polimeryzacji 5 '-> 3'. Enzym I polimerazy DNA może również usuwać dimery tyminy wytworzone w wyniku naświetlania UV i wypełnić lukę w wyniku wycięcia. Nazywa się to sprawdzaniem lub edytowaniem funkcji tego enzymu.

Polimeraza DNA-II:

Enzym ten przypomina w swojej aktywności polimerazę I DNA, ale jest enzymem naprawczym DNA i powoduje wzrost w kierunku 5 '-> 3', przy użyciu wolnych grup 3'-OH.

Polimerazy DNA-III:

Odgrywa zasadniczą rolę w replikacji DNA. Jest to multimeryczny enzym lub holoenzym mający dziesięć podjednostek, takich jak α, β, ε, θ, г, y, δ, δ ', x i Ψ. Wszystkie te dziesięć podjednostek wymagają replikacji DNA in vitro; jednak wszystkie mają różne funkcje. Na przykład, podjednostka α ma 3 * -> 5 'aktywność korekty eksonukleazy lub edycji. Enzym rdzeniowy zawiera trzy podjednostki - α, β i θ. Pozostałe siedem podjednostek zwiększa procesowość (przetwarzalność oznacza szybkość i wydajność, z jaką polimeraza DNA przedłuża łańcuch wzrostu).

Eukariotyczna polimeraza DNA:

Uważa się, że białka Yukai (np. Drożdże, wątroba szczura, ludzkie komórki nowotworowe) zawierają następujące pięć typów polimeraz DNA:

(i) polimeraza DNA α:

Ten względnie wysoki ciężar cząsteczkowy enzymu jest również nazywany polimerazą cytoplazmatyczną lub dużą polimerazą. Występuje zarówno w jądrze, jak iw cytoplazmie.

(ii) polimeraza DNA β:

Ten enzym jest również nazywany polimerazą jądrową lub małą polimerazą i występuje tylko u kręgowców.

(iii) polimeraza DNA y:

Ten enzym nazywa się mitochondrialną polimerazą i jest kodowany w jądrze.

(iv) polimeraza DNA δ:

Enzym ten znajduje się w komórkach ssaków i jest zależny od PCNA pod względem zdolności do syntezy DNA (PCNA = jądrowy antygen komórek proliferujących).

(v) polimeraza DNA ε:

Był wcześniej znany jako polimeraza DNA 5II. Ten enzym jest niezależny od PCNA i występuje w komórkach ssaczych HeLa i pączkujących drożdżach.

Duża polimeraza DNA a jest dominującym enzymem polimerazy DNA jest komórkami eukariotycznymi i przez długi czas była uważana za jedyny enzym zaangażowany w replikację DNA. Ale teraz odkryto, że jeszcze jedna polimeraza, mianowicie polimeraza DNA 8, bierze udział w replikacji DNA eukariotycznego.

DNA Primers:

Enzymy te katalizują syntezę starterów RNA, które są niezbędne do zainicjowania replikacji DNA w ogromnej większości organizmów. Zanim rozpocznie się replikacja DNA, krótkie segmenty oligonukleotydowe RNA, zwane primerami RNA lub po prostu primerami, muszą zostać zsyntetyzowane przez enzym DNA primazy przy użyciu trifosforanów rybonukleozydu.

Ten primer RNA syntetyzuje się, kopiując określoną sekwencję zasad z jednej nici DNA i różni się od typowej cząsteczki RNA tym, że po syntezie starter pozostaje związany wodorowo z matrycą DNA.

Startery mają około 10 nukleotydów w eukariotach i są wytwarzane w odstępach na nici opóźniającej, gdzie są wydłużane przez enzym polimerazę DNA, aby rozpocząć każdy fragment okazaki. Te primery RNA są później wycinane i wypełniane DNA za pomocą systemu naprawy DNA u eukariotów.

W bakteriach wiadomo, że dwa różne enzymy syntetyzują oligonukleotydy RNA startera - polimerazę RNA (na wiodącej nici) i primazę DNA (na nici opóźniającej).

Ligaza polinukleotydowa:

Enzym ten jest ważnym enzymem zarówno w replikacji DNA, jak iw naprawie DNA. Ligaza DNA katalizuje tworzenie wiązań fosfodiestrowych między grupą 5'-fosforylową jednego nukleotydu i grupą 3-OH najbliższego sąsiada po stronie nici w nici DNA; w ten sposób zamyka on nicki w nici DNA.

Endonukleazy:

Endonukleazy, w szczególności endonukleazy restrykcyjne, są również ważne podczas replikacji DNA, jak również naprawy DNA. Podczas replikacji DNA, endounclease może wytworzyć nicka w miejscu inicjacji replikacji lub może wywołać nicky w celu wygenerowania obrotówki dla ułatwienia odwijania DNA.

Enzymy zaangażowane w otwarcie DNA Helix:

Helicases DNA:

Helicazy DNA są zależnymi od ATP enzymami odszczepiającymi, które promują oddzielenie dwóch nici macierzystych i ustanawiają widełki replikacyjne, które będą stopniowo oddalać się od miejsca pochodzenia. Rozwijanie helisy DNA matrycy w widełkach replikacyjnych może w zasadzie być katalizowane przez dwie helikazy DNA, działające w połą- czeniu, jedna biegnąca wzdłuż wiodącej nici, a druga wzdłuż nici opóźniającej.

Nici destabilizujące helisę (zwane również białkami wiążącymi się z pojedynczą nicią DNA lub SSBP):

Za widelcem do replik, pojedyncze nici DNA nie są w stanie przewijać się nawzajem (lub tworzyć dwuniciowe pętle spinki do włosów w każdej pojedynczej nici) przez działanie białek SSB. Białka SSB wiążą się z odsłoniętymi nitkami DNA bez pokrywania zasad, które w związku z tym pozostają dostępne dla procesu szablonowego.

Topoizomerazy (gyrazy DNA):

Działanie helicazy wprowadza pozytywną superkoilę w dupleks DNA przed widełkami replikacji. Enzymy, zwane topoizomerazami, rozluźniają supergłązkę poprzez przymocowanie do przejściowo supercoilowego dupleksu, nacinanie jednego z pasm i obracanie go przez nieprzerwane pasmo. Nit jest ponownie zapieczętowany.

Jeden rodzaj topoizomerazy (tj. Topoizomeraza I) powoduje pęknięcie pojedynczej nici lub nicka, co pozwala dwóm sekcjom helisy DNA po dowolnej stronie nicka obracać się swobodnie względem siebie, stosując wiązanie fosfodiestrowe w nici naprzeciwko nici jako punkt skrętu. Drugi rodzaj topoizomerazy (tj. Topoizomeraza II) tworzy kowalencyjne wiązanie z obydwoma niciami helisy DNA w tym samym czasie, powodując przejściową dwuniciową przerwę w helisie.

Replicon:

Replikon jest jednostką DNA, w której zachodzą poszczególne akty replikacji, tj. Jest zdolna do replikacji DNA niezależnie od innych segmentów DNA. Dlatego każdy replikon ma początek, w którym zainicjowana jest replikacja i może mieć koniec, na którym replikacja się zatrzymuje.

Chromosomy bakteryjne i wirusowe zazwyczaj zawierają pojedynczy replikon / chromosom. Chociaż fag T ma dwa pochodzenie, jeden pierwotny i jeden drugorzędny, ale w obecności pierwotnego pochodzenia, wtórne pochodzenie jest z reguły niefunkcjonalne. W E. coli punkt początkowy jest identyfikowany jako locus genetyczne oriC.

Kompletne pochodzenie prokariotyczne obsługuje następujące trzy funkcje: (1) inicjacja replikacji, (2) kontrola częstotliwości zdarzeń inicjujących i (3) segregacja replikowanych chromosomów do komórek potomnych.

Rozpoznano źródła w bakteriach, drożdżach, chloroplastach i mitochondriach; ich istotną ogólną cechą jest to, że są bogate w A: T, co może być ważne dla ułatwienia odwijania podczas replikacji. Pochodzenie bakterii zawiera wiele różnych krótkich (<10 pz) miejsc, które są potrzebne do jego funkcjonowania; te strony są czasami oddzielone przez określone odległości, ale nie przez określone sekwencje. Te specyficznie zlokalizowane miejsca są potrzebne do wiązania różnych białek zaangażowanych w replikację DNA.

Kilka replikonów prokariotycznych posiada określone miejsca, zwane terminami, które zatrzymują ruch widelczy replikacji, a tym samym kończą replikację DNA. Chromosom E. coli ma dwa termingi, zwane T1 i T2, położone około 100 kb po obu stronach punktu, w którym spotykają się widełki replikacyjne. Każdy koniec jest specyficzny dla jednego kierunku ruchu wideł.

T1 i T2 są rozmieszczone w taki sposób, że każdy z widełek powinien przechodzić drugi, aby dotrzeć do określonego dla niego terminala. Zakończenie replikacji wymaga produktu genu tus, który prawdopodobnie koduje białko, które rozpoznaje T i T2.

W eukariotach każdy chromosom ma kilka replikonów (np. Drożdże, 500, Drosophila, 3500, mysz 25 000, Viciafaba, 35 000). W dowolnym momencie podczas fazy S tylko niektóre z tych replikonów podlegają replikacji; każdy replikon wydaje się aktywowany w określonym czasie w określonej sekwencji. Długość replikonu eukariotycznego może wahać się od 40 kb w drożdżach i Drosophila do około 300 kb w Vicia.

Liczba wykrywalnych replikonów wydaje się różnić w zależności od stadium rozwojowego i typu komórki lub tkanki. Wyjaśniono to na podstawie specyficznego pochodzenia tkankowego, tak, że niektóre pochodzenie jest aktywne w niektórych tkankach, podczas gdy inne są aktywne w niektórych innych tkankach.

Przykładem tego jest Drosophila, gdzie wczesne komórki embrionalne mają 10 razy więcej replikonów niż te w dorosłych komórkach somatycznych. Dostępne dowody sugerują, że replikony eukariotyczne nie mają terminów.

Wierność replikacji:

Stopień błędu replikacji DNA jest znacznie niższy niż w przypadku transkrypcji, ponieważ istnieje potrzeba zachowania znaczenia przekazu genetycznego z pokolenia na pokolenie. Na przykład spontaniczna szybkość mutacji w E. coli wynosi około jeden błąd na 10 ¹⁰ zasad wprowadzonych podczas replikacji.

Wynika to głównie z obecności niewielkich tautomerycznych postaci zasad, które mają zmienione właściwości parowania zasad. Wskaźnik błędów jest minimalizowany przez różne mechanizmy. Polimeraza DNA będzie zawierała tylko nadchodzący nukleotyd, jeśli tworzy prawidłową parę zasad z wzorcowym nukleotydem w swoim miejscu aktywnym.

Okazjonalny błąd jest wykrywany przez egzonukleazę 3 '-> 5' związaną z polimerazą. Usuwa to nieprawidłowy nukleotyd z końca 3 'przed jakimkolwiek dalszym inkorporowaniem, umożliwiając polimerazie następnie wstawienie prawidłowej zasady. Aby poprawiona egzonukleaza działała prawidłowo, musi być w stanie odróżnić prawidłową parę zasad od niewłaściwej.

Zwiększona ruchliwość "nieusuniętych" par zasad na samym 5'-końcu nowo zainicjowanych fragmentów nici opóźniających DNA oznacza, że ​​nigdy nie wydają się poprawne i dlatego nie można ich sprawdzić. W związku z tym pierwsze kilka nukleotydów to rybonukleotydy (RNA), które następnie można zidentyfikować jako materiał o niskiej wierności i zastąpić DNA wydłużonym (i skorygowanym) z sąsiedniego fragmentu. Błędy, które nie wymagają korekty, są korygowane przez mechanizm naprawy niedopasowania.

Mechanizm replikacji DNA u Prokaryota:

Replikacja DNA in vitro została szeroko przebadana w E. coli oraz w fagach i plazmidach E. coli. W E. coli proces replikacji DNA obejmuje następujące trzy główne etapy:

1. Rozpoczęcie replikacji DNA:

Ten proces obejmuje trzy etapy: (i) rozpoznawanie pochodzenia (O), (ii) otwarcie dupleksu DNA w celu wytworzenia regionu jednoniciowego DNA i (iii) wychwytywanie białka Dna B (tj. Helisy 5 '3'). ; działa także jako aktywator primase). Tak więc, kompleks ATP Dna-A (lub białka inicjatora) wiąże się z odwróconymi regionami powtórzeń 9 pz (R, R, RvR4) oriC E. coli i sprzyja otwarciu dupleksu DNA w regionie składającym się z trzech części. bezpośrednie powtórzenia sekwencji 13-bp (zwane 13-mers).

Otwarcie następuje od prawej 13-merowej w lewo i wymaga ujemnie superskręconego DNA i białek inicjatora HU lub IHF. Dna B (-helikaza) jest przenoszona do odsłoniętego jednoniciowego DNA i powoduje odwijanie DNA w obecności gyrazy ATE, SSB i DNA (topoizomeraza).

Powoduje to rozwijanie dupleksu DNA, a replikacja z ori C przebiega w obu kierunkach (dwukierunkowo); Wiązanie SSB występuje w regionach jednoniciowych, a dwa kompleksy Dna B (= primosomy) są ładowane po jednym na każdą nić.

2. Wydłużanie łańcucha DNA:

Ten etap wymaga obecności następujących enzymów i czynników: 1. Dna B lub helikaza (zwana także mobilnym promotorem); 2. primase (Dna G); 3. Holoenzym polimerazy DNA (lub DNA pol III HE); 4. Białko SSB; 5. RNAaza H, która usuwa startery RNA; 6. Polimeraza DNA I stosowana do wypełniania luki wytworzonej przez startery RNA i 7. ligazę DNA (która przekształca beznarzędziowe fragmenty okazaki w ciągłą nić). Podczas przejścia inicjującego do wydłużenia występują następujące zdarzenia:

(i) Gdy helicase (lub Dna B) przemieszcza się w kierunku 5 '-> 3', generuje widełki replikacji poprzez otwarcie dupleksu DNA.

(ii) Nić DNA mająca helikazę staje się pasmem opóźniającym. Proteaza DNA wiąże się z helicazą Dna B, tworząc primosom syntetyzujący wiele starterów dla nici opóźniającej i primera dla pojedynczego RNA dla wiodącej nici.

(iii) Do syntezy pasma opóźniającego, DNA pol III HE musi pracować na tej samej nici, do której związana jest heliina Dna B, ale podróżuje w przeciwnym kierunku.

(iii) Helicaza DnaB, Dna Gprimase i DNA pol III FIE współdziałają w wydłużaniu nici. Helicaza i agregacja polimerazy DNA pozostaje procesywna, tj. Pozostają ściśle związane z widelcem i pozostają związane podczas reakcji.

Synteza (- wydłużanie) wątków opóźniających i wiodących odbywa się za pomocą nieco odmiennych metod; jest znacznie bardziej złożona dla pasma opóźniającego niż dla wiodącego pasma:

(A) Nieciągła synteza na wątku opóźniającym:

1. Primaza jest pobierana z roztworu i jest aktywowana przez helikazę (DnaB) w celu syntezy startera aRNA (o długości 10 do 20 nukleotydów lub nukleotydów) na nici opóźniającej.

2. Startery RNA są rozpoznawane przez DNA pol III HE na nić opóźniającą i są wykorzystywane do syntezy fragmentów prekursorowych lub okazaki. W rzeczywistości każdy nowy starter RNA jest rozpoznawany przez podjednostkę gamma (y) DNA pol III HE i ładowany podjednostką p tej samej polimerazy. Ta wstępnie załadowana podjednostka p może następnie wychwycić rdzeń DNA poli III HE, gdy stanie się dostępny po zakończeniu syntetycznej pracy na poprzednim fragmencie okazaki.

3. Po zakończeniu fragmentów okazaki, startery RNA są wycinane przez polimerazę DNA 1, która następnie wypełnia powstałe luki DNA.

4. Po zastosowaniu polimerazy DNA I dodaje końcowe dezoksyrybonukleotydy w szczelinie pozostawionej przez wycięty starter, ligaza enzymatyczna DNA odsyła do wiązania fosfodiestrowego, które łączy wolny koniec 3 'zamiennika startera z końcem 5' fragmentu okazaki.

(B) Ciągła synteza wiodącej nici:

1. W dwukierunkowej replikacji DNA, wiodąca nić jest zagruntowana raz na każdej z nici rodzicielskich.

2. Starter RNA wiodącej nici syntetyzowany jest przez enzym polimerazy RNA.

3. DNA pol III HE powoduje wydłużenie wiodącej nici i ostatecznie DNA pol 1 i enzymy ligazy dają ostateczny kontakt z wiodącą nicią, jak w przypadku nici opóźniającej.

Replikacja DNA w eukariotach :

Eukariotyczna replikacja DNA wymaga dwóch różnych enzymów polimerazy DNA, a mianowicie polimerazy DNA A i polimerazy DNA δ. Polimeraza DNA δ syntetyzuje DNA na wiodącej nici (ciągła synteza DNA), podczas gdy polimeraza DNA syntetyzuje DNA na nici opóźniającej (nieciągła synteza DNA). Oprócz tych dwóch enzymów, replikacja DNA: (1) antygen T; (2) współczynnik replikacji A lub RF-A (zwany także RP-A lub eukariotycznym SSB); (3) topoizomeraza I; (4) topoizomeraza II; (5) proliferujący - antygen jądrowy komórki (PCNA, również nazywany cykliną) i (6) czynnik replikacji Cor RF-C.

Proces replikacji DNA eukariotycznego obejmuje następujące etapy:

1. Przed rozpoczęciem syntezy DNA występuje presyntetyczny etap trwający 8-10 minut w celu utworzenia niezwiązanego kompleksu DNA. Ten etap wymaga tylko trzech oczyszczonych białek, a mianowicie antygenu T (T-ag lub antygenu nowotworowego), RF-A i toposomerazy I i II.

2. Antygen T, wykorzystując swoją domenę wiążącą DNA, tworzy wielopodjednostkowy kompleks z miejscem I i miejscem II w obecności A TP i spowodował lokalne rozwijanie.

3. Bardziej rozległe rozwijanie dupleksu występuje z powodu połączenia RF-A i topoizomerazy za pomocą - z pomocą komponentu helikazy DNA T-temu Topoizomerazy pomaga w odwijaniu DNA przez zmianę topologii DNA w widełkach replikacyjnych.

4. Białka RF-A lub SSB wiążą się z rozwijanym jednoniciowym DNA.

5. Synteza RNA startera jest wykonywana przez primazę, która jest ściśle związana z polimerazą DNA ex.

6. Polimeraza DNA pomaga w syntezie fragmentu okazaki w kierunku 5 'do 3'.

7. Współczynnik replikacji C (lub RF-C) i PCNA (cyklina) pomagają w przełączaniu polimerazy DNA tak, że pola jest zastępowana przez pol 5, który następnie w sposób ciągły syntetyzował DNA na wiodącej nici.

8. Kolejny fragment okazaki jest następnie syntetyzowany z widelca replikacyjnego na nici opóźniającej przez kompleks pol-primase i ten etap jest powtarzany wielokrotnie, aż cała cząsteczka DNA zostanie pokryta.

9. Startery RNA są usuwane, a szczeliny są wypełniane jak w prokariotycznej replikacji DNA.

Ostatnio podkreślono rolę polimerazy DNA e w replikacji DNA, tak więc wiadomo, że trzy polimerazy DNA (a, δ i ε) są zaangażowane w replikację DNA eukariotycznego. A. Sugino i współpracownicy zaproponowali, że polimeraza DNA może działać zarówno na wiodących, jak i opóźniających łańcuchach (ponieważ polimeraza a ma aktywność α-primazy), podczas gdy polimeraza e i polimeraza 5 uczestniczą w wydłużaniu odpowiednio wiodącej i opóźniającej nici.

Mechanizm uszkadzania i naprawy DNA

Rodzaje uszkodzeń DNA:

1. Zmiany DNA:

Zmiana w normalnej chemicznej lub fizycznej strukturze DNA jest tak zwana jak uszkodzenie DNA. Wiele czynników egzogennych, takich jak chemikalia i promieniowanie, może powodować zmiany pozycji atomów azotu i węgla w heterocyklicznych układach pierścieniowych zasad i niektórych egzocyklicznych grup funkcyjnych (tj. Grup keto i aminowych zasad).

Może to prowadzić do utraty parowania zasad lub zmienionego parowania zasad (np. Zmieniona A może parą zasad z C zamiast T). Jeśli takie uszkodzenie pozostanie w DNA, mutacja może zostać utrwalona w DNA przez bezpośrednią lub pośrednią mutagenezę.

Alternatywnie, zmiana chemiczna może powodować fizyczne zniekształcenie w DNA, które blokuje replikację i / lub transkrypcję, powodując śmierć komórki. Zatem uszkodzenia DNA mogą być mutagenne i / lub śmiertelne. Niektóre uszkodzenia są spontaniczne i występują ze względu na nieodłączną reaktywność chemiczną DNA i obecność normalnych, reaktywnych związków chemicznych w komórce.

Na przykład, podstawowa cytozyna ulega spontanicznemu procesowi deaminacji w celu uzyskania uracylu. Jeśli pozostawiony bez naprawy, powstały uracyl tworzyłby zasadową parę z adeniną podczas kolejnej replikacji, dając początek mutacji punktowej. Depuracja jest kolejną spontaniczną reakcją hydrolityczną, która obejmuje rozszczepienie wiązania N-glikozylowego między N-9 zasad purynowych A i G i C-1 'dezoksyrybozy cukrowej, a tym samym utratę zasad purynowych z DNA. Szkielet cukrowo-fosforanowy DNA pozostaje nienaruszony. Powstałe w ten sposób miejsce apurynowe jest zmianą niekodującą, ponieważ informacja zakodowana w bazach purynowych zostaje utracona.

2. Uszkodzenie oksydacyjne:

Dzieje się tak w normalnych warunkach ze względu na obecność reaktywnych form tlenu (ROS) we wszystkich komórkach tlenowych, na przykład nadtlenku, nadtlenku wodoru i, co najważniejsze, rodnika hydroksylowego (OH). Ten rodnik może atakować DNA, I w wielu punktach, wytwarzając szereg produktów utleniania o zmienionych właściwościach II, na przykład 8-oksoguanina, 2-oksoadenina i 5-formylouracyl. Ich poziomy można zwiększyć za pomocą rodników hydroksylowych z radiolizie wody spowodowanej promieniowaniem jonizującym.

3. Alkilowanie:

Środki alkilujące są elektrofilowymi związkami chemicznymi, które łatwo dodają grupy alkilowe (np. Metylowe) do różnych pozycji w kwasach nukleinowych różniących się od metylowanych normalnymi enzymami metylującymi. Typowymi przykładami są sulfonian metylu (MMS) i etylonitrosomocznik (ENU).

Typowymi przykładami metylowanych zasad są 7-metyloguanina, 3-metylo-adenina, 3-metyloguanina i 0 ⁶ -metyloguanina. Niektóre z tych zmian są potencjalnie śmiertelne, ponieważ mogą zakłócać rozwijanie DNA podczas replikacji i transkrypcji. Większość jest również pośrednio mutagenna; jednak 0? ^6- metyloguanina jest mutagenem bezpośrednio mutagennym, ponieważ może par zasad z tyminą podczas replikacji.

4. Duże addukty:

Cyklobutanowe pirymidynowe dimery są tworzone przez światło ultrafioletowe z sąsiednich pirymidyn na jednej nici przez cyklizację podwójnie związanych C5 i C6 atomów węgla każdej zasady z wytworzeniem pierścienia cyklobutanowego. Wynikająca z tego utrata parowania zasad z przeciwną nicią powoduje lokalną denaturację DNA powodującą masywne uszkodzenie, które zakłóciłoby replikację i transkrypcję. Inny typ dimeru pirymidynowego, 6, 4-foto-produktu, wynika z utworzenia wiązania pomiędzy C6 jednej zasady pirymidynowej i C4 sąsiedniej zasady.

Gdy rakotwórczy smoła węglowa benzo [a] piren jest metabolizowany przez cytochrom P-450 w wątrobie, jeden z jej metabolitów (epoksyd diolu) może kowalencyjnie przyłączać się do grupy 2-aminowej reszt guaniny. Wiele innych aromatycznych środków arylujących tworzy kowalencyjne addukty z DNA. Wątroba rakotwórcza aflatoksyna B, również kowalencyjnie wiąże się z DNA.

Naprawa DNA:

Systemy naprawcze rozpoznają różne zmiany w DNA, aby zainicjować działanie. Komórka może mieć kilka systemów do radzenia sobie z uszkodzeniem DNA. Systemy te obejmują: (1) bezpośrednią naprawę, (2) naprawę wycięcia (3) naprawę niedopasowania, (4) systemy tolerancji i (5) systemy pobierania.

1. Bezpośrednia naprawa:

Odwrócenie lub proste usunięcie uszkodzenia DNA jest znane jako bezpośrednia naprawa, np. Usunięcie kowalencyjnych wiązań pomiędzy dwoma 4 i dwoma 5 atomami węgla dwóch reszt tyminy uczestniczących w tworzeniu dimerów tyminy.

Dimery tyminowe są generalnie tworzone z powodu naświetlania UV i zakłócają replikację i transkrypcję. Kelner (1949) zaobserwował, że duża liczba bakterii może przetrwać duże dawki promieniowania UV; jeśli były wystawione na intensywne źródło światła widzialnego.

Zjawisko to nazywa się fotoreaktywacją. Wykazano później, że podczas napromieniowania UV konkretny enzym jest selektywnie związany z bakteryjnym DNA. Podczas procesu fotoreaktywacji enzym aktywowany jest za pomocą światła widzialnego. Rozszczepia dimery tyminy, przywracając je do pierwotnej postaci. Ten proces naprawy jest zależny od enzymu i zależy od światła.

2. Naprawa wycięcia:

W tym mechanizmie naprawczym uszkodzony lub zmieniony odcinek nici DNA jest wycinany, a na jego miejscu syntetyzowana jest nowa łata DNA. Chociaż systemy naprawy wycinków różnią się swoją specyfiką, główna ścieżka obejmuje następujące trzy etapy:

(i) Rozpoznanie i nacięcie:

Uszkodzony / zmieniony odcinek nici DNA jest rozpoznawany przez endonukleazę; ten enzym następnie odcina dotknięte pasmo po obu stronach uszkodzeń.

(ii) Wycięcie:

Egzonukleaza 5 '-> 3' (polimeraza DNA I) trawi uszkodzoną / zmienioną sekcję; generuje to jednoniciowy region podwójnej helisy DNA.

(iii) Synteza:

W tym etapie jednoniciowy region wytwarzany przez wycięcie służy jako matryca dla polimerazy DNA, która syntetyzuje zastąpienie wycinanego segmentu. Ligaza DNA następnie uszczelnia nicka, która pozostaje po syntezie zastępującej wyciętej części.

W E. coli wycięcie najprawdopodobniej wynika z aktywności egzonukleazy 3 '-> 5' polimerazy DNA I, podczas gdy syntezę prowadzi się za pomocą aktywności polimerazy 5 '-> 3' tego samego enzymu. Systemy naprawcze wycinania są dość powszechne zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niektóre z tych systemów rozpoznają ogólne uszkodzenia DNA, podczas gdy inne są bardzo specyficzne, np. Endonukleazy AP usuwają reszty rybozy z miejsc depuracji. Naprawa wycięcia obejmuje różne długości DNA i jest podzielona na następujące trzy klasy:

(a) Naprawianie bardzo krótkiej łatki (VSP):

Ten system zajmuje się naprawą niedopasowań między określonymi podstawami.

(b) Krótki remont łaty:

W tym systemie wycina się nić DNA o długości 20 zasad, a uszkodzenia naprawia się za pomocą genów uvr (uvr, A, B, C, E. coli), kodując komponenty endonukleazy naprawczej. Inny enzym uvr jest również potrzebny do aktywności helikazy.

(c) Naprawa długich łat:

Ten system obejmuje wycinanie około 1500 podstawowych odcinków, ale czasami wycięty odcinek może wynosić> 9000 zasad. Jest on znacznie mniej powszechny i ​​musi zostać wywołany przez uszkodzenie, które blokuje replikację. W E. coli ten system obejmuje także geny UV i polimerazę DNA I.

3. Naprawa niedopasowania:

Polega na korekcie niedopasowań lub parowaniu między zasadami, które nie są komplementarne. Niedopasowanie może powstać (a) podczas replikacji lub (b) z powodu zmian zasad (np. Deaminacji cytozyny do uracylu) i powoduje zniekształcenia strukturalne w podwójnej helisie DNA. Te zmiany są obsługiwane w E. coli przez system naprawczy o bardzo krótkiej łatce, który opisano poniżej.

System naprawy niedopasowań w E. coli:

Gdy występuje niezgodność w parze bazowej, tak jak w GC -> GT, teoretycznie może ona ulec naprawie, powodując powstanie typu dzikiego (GC) lub typu zmutowanego (AT). Dlatego system naprawczy musi rozróżniać stare i nowe nici i naprawiać tylko nowe nici, aby przywrócić dziki typ.

Odbywa się to za pomocą systemu naprawczego o bardzo krótkiej łatce i wymaga czterech białek, a mianowicie Mut L, Mut S, Mut U i Mut H kodowanych odpowiednio w E. coli przez geny mut L, mut S, mut U i mut H. Błędy niedopasowania produkowane podczas replikacji są korygowane przez system naprawy dam.

Tama genowa E. coli wytwarza metylazę metylującą adeninę o sekwencji GATC na obu niciach DNA. Replikacja w pełni metylowanej sekwencji GATC daje hemimetylowaną sekwencję, w której reszty A w nowo syntetyzowanych niciach nie są metylowane.

Nie metylowany stan tej docelowej sekwencji jest stosowany do identyfikacji nowej nici; podstawy wokół miejsca niezgodności w nowej nici są wycinane i syntetyzuje się zamiennik. System obejmuje produkty genów mut L, mut S, mut H i uvr D.

Retrieval Systems Naprawy:

Systemy te są również znane jako "naprawa po replikacji" lub "naprawa rekombinacji". W E. coli ten system naprawy opiera się na genie recA, który wytwarza białko RecA. Rec A białko funkcjonuje w wymianie pasm między cząsteczkami DNA podczas rekombinacji genetycznej, a także działa w wymianie pojedynczej nici podczas naprawy rekombinacji. Wydaje się, że istnieją dwa szlaki recA, jeden z udziałem genów recB, C i drugi z udziałem F.

Ten system naprawczy działa, gdy zniekształcenie strukturalne blokuje replikację w uszkodzonym miejscu. Na przykład, mutanty E. coli z brakiem naprawy wycinków nie będą w stanie usunąć dimerów tyminy. W takiej sytuacji replikacja przebiega normalnie do uszkodzonych miejsc; polimeraza DNA zatrzymuje replikację dotkniętego wątku i ponownie inicjuje replikację pomijając uszkodzone miejsce.

Komplementarna nić jest replikowana normalnie w uszkodzonym miejscu w drugiej nici. Zatem replikacja daje jedno normalne potomstwo cząsteczki DNA i jedną cząsteczkę zawierającą dimer tyminy w jednej nici i długą przerwę w swojej komplementarnej nici. Potomstwo DNA z dimerem tyminy zostanie utracone, chyba że zostanie naprawione przez wypełnienie luki w jednej z jej nici.

Osiąga się to za pomocą wymiany pojedynczej nici pomiędzy dwiema potomnymi cząsteczkami DNA; region wymiany wypełnia lukę i jest indukowany przez białko Rec A. W wyniku tej wymiany normalna cząsteczka potomna ma jednoniciowy region, który ma przerwę. Luka ta jest naprawiana przez syntezę DNA.

System tolerancji:

Systemy te radzą sobie z uszkodzeniami, które blokują normalną replikację w uszkodzonym miejscu, prawdopodobnie umożliwiając replikację uszkodzonych stron z dużą częstotliwością błędów. Systemy te mogą być szczególnie ważne w eukariontach, gdzie rozmiar genomu jest bardzo duży, a zatem całkowita naprawa uszkodzeń jest raczej mało prawdopodobna.