Przydatne uwagi na temat testów aktywacji limfocytów
Funkcjonalne zdolności limfocytów w odpowiedzi na antygeny lub mitogeny są określane przez testy aktywacji limfocytów.
W związku z tym testy aktywacji limfocytów są bardziej odpowiednie do oceny immunokompatybilności osobnika niż proste wyliczenie limfocytów.
Istnieją dwa rodzaje testów aktywacji limfocytów:
ja. Wykrywanie "markerów aktywacji" na powierzchni limfocytów.
ii. Ocena zdolności limfocytów do proliferacji po stymulacji komórek T.
Najczęściej stosowanym bodźcem komórek T do oceny proliferacji limfocytów T są:
ja. Lektyny [takie jak fitohemaglutynina (PHA) i konkanawalina A (ConA)
ii. Bakteryjne toksyny, które działają jako super antygeny
iii. Związki chemiczne [takie jak octan mirystynianu forbolu (PMA), jonofory wapnia
iv. Cytokiny
v. mAb do receptorów powierzchniowych (zwłaszcza cząsteczek CD3 na limfocytach T)
Aktywacja komórek B jest indukowana przez:
ja. Mitogen szkarłatki (PWM). PWM aktywuje również komórki T
ii. Super antygeny
iii. Lipopolisacharydy
iv. mAbs, które sieciują slgs na powierzchni komórek B.
za. Oczyszczone limfocyty hoduje się w 96-studzienkowych dołkach mikrotitracyjnych i stymuluje antygenem lub mitogenem (zwykle przez 48 godzin).
↓
Do studzienek dodano trytowaną tymidynę (3H-Tdr) i inkubowano
↓
Zawartość studzienek zostaje zassana i przefiltrowana na filtrach, a zmierzona zostaje 3 H Tdr w bibule filtracyjnej. Włączenie 3H-Tdr do chromosomalnego DNA odzwierciedla proliferację komórek.
b. Istnieją nieradioaktywne testy w celu określenia proliferacji komórek. Testy te wykorzystują barwniki fluorescencyjne, które wprowadzają do DNA lub barwniki, które mierzą oddychanie oksydacyjne, takie jak MTT.
do. Bromodeoksyurydyna (BrdU) jest włączona do DNA wysoce replikujących się komórek, a zatem może być stosowana do oceny proliferacji komórek. Włączone BrdU w komórkach wykrywa się za pomocą mAb przeciwko BrdU i cytometrii przepływowej (jak wykrywanie wewnątrzkomórkowych antygenów za pomocą cytometrii przepływowej).
BrdU można także podawać pacjentom z rakiem in vivo, a następnie można dokonać resetu guza i ocenić komórki nowotworowe pod kątem inkorporacji BrdU. Test ten dostarcza wyobrażenia o frakcji proliferacyjnej komórek nowotworowych u pacjenta.
re. Aktywację komórek T cytotoksycznych badano za pomocą testu uwalniania chromu 51 :
Komórki docelowe są znakowane radioaktywnym chromem ( 51 Cr), które wiąże się z białkami wewnątrzkomórkowymi komórek docelowych.
↓
Wyznakowane komórki docelowe inkubuje się z cytotoksycznymi limfocytami T.
↓
Lizowanie komórek docelowych przez cytolityczne komórki T skutkuje uwolnieniem 51 Cr.
Komórki odwirowuje się i mierzy się uwolniony 51 Cr w supernatancie. Ilość uwolnionych 51 Cr jest proporcjonalna do lizy komórek.
