Testy funkcji neutrofilów

Testy aktywności neutrofilów!

1. Chemotaksję neutrofili można ocenić za pomocą następujących metod:

za. Zmodyfikowana próba komory Boydena:

Komora Boydena składa się z górnej i dolnej komory oddzielonej filtrem o małych rozmiarach porów.

Zawiesinę neutrofili umieszcza się w górnej komorze, a substancję chemotaktyczną umieszcza się w dolnej komorze. Stopień migracji neutrofilów ocenia się przez zliczenie liczby neutrofili uwięzionych w filtrze i liczby neutrofili w dolnej komorze za pomocą cytometrii przepływowej.

b. Studnie są wytłaczane na półstałym agarze:

Zawiesinę neutrofili, substancję chemotaktyczną i substancję niechemotyczną umieszcza się w różnych studzienkach. Migrację komórek przez półstały agar do studzienki zawierającej substancję chemotaktyczną określa się mikroskopowo. Migracja w kierunku substancji nie chemotaktycznej dobrze reprezentuje losowy ruch komórek (znany jako chemokinezy).

2. Fagocytoza neutrofilowa:

Do oceny zdolności fagocytarnej neutrofili można wykorzystać różne cząstki. Cząstki są inkubowane z neutrofilami, a następnie obserwowane mikroskopowo pod kątem obecności cząstek wewnątrz neutrofili. Cząstki związane z powierzchnią komórek są usuwane za pomocą kwasu, tak że cząstki związane z powierzchnią komórki nie są liczone jako cząstki wewnątrzkomórkowe.

Dostępne są również fluorescencyjne cząsteczki znakowane lub radioaktywne, które umożliwiają bezpośrednie zliczanie cząstek przez fagocyty.

3. Oznaczanie wybuchu oddechowego i degranulacji:

Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD) jest chorobą niedoboru odporności, w której na wewnątrzkomórkowe zabijanie przez fagocyty wpływ ma niezdolność komórek fagocytujących do wytworzenia anionu supertlenkowego (O2 ^- ).

za. Test suwakowy Nitroblue tetrazolium (NBT):

NBT jest klarownym, żółtym, rozpuszczalnym w wodzie barwnikiem. NBT zostaje zredukowany do ciemnoniebieskiego, formazon przez O ₂ ^- . Neurobiony są aktywowane przez traktowanie PMA lub ekspozycję na LPS. Aktywowane neutrofile są następnie inkubowane z NBT. Jeśli neutrofile wytwarzają O2 ^-, NBT zostaje zredukowany do ciemnoniebieskiego formazonu i jest wizualizowany pod mikroskopem. Badanie ilościowe można wykonać przez ekstrakcję formutu z neutrofili i oznaczenie formazonu spektrofotometrem. Dzieci z całkowitym niedoborem aktywności oksydazy NADPH wykazują rażący niedobór testu NBT. Ale dzieci z częściową utratą aktywności oksydazy NADPH lepiej wykrywa się za pomocą testu ilościowego.

b. Test cytometrii przepływowej z użyciem 2'7'-dichloro-fluoresceiny (DCF):

O ₂ ^- powstały podczas oksydazy NADPH przekształca się w H ₂ O ₂ przez enzym dysmutazę ponadtlenkową. H ₂ O ₂ to kolejna mikrobiobójcza substancja chemiczna. H ₂ O ₂ utlenia niefluorescencyjny związek DCF do związku fluorescencyjnego, który jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Fagocyty są inkubowane z DCF i DCF wchodzącymi do komórek.

↓

Następnie neutrofile są aktywowane przez PMA lub inne czynniki.

↓

Następnie komórki analizuje się w cytometrze przepływowym. Określono wzrost w florescence fagocytów.

Cytometr przepływowy umożliwia również ilościowe oznaczanie H202 wytwarzanego przez poszczególne komórki. Stąd analiza cytometrii przepływowej jest przydatna w wykrywaniu częściowych defektów w funkcji oksydazy NADPH lub w badaniach przesiewowych pod kątem heterozygotycznych nosicieli CGD związanych z X.

4. Degranulacja fagocytów:

Degranulacja fagocytarna to proces fuzji lizosomów z fagosomami, prowadzący do uwolnienia zawartości lizosomu do fagolizosomu. Degranulacja jest procesem aktywnym i wymaga energii. Upośledzenie normalnych szlaków metabolicznych neutrofilów (zwłaszcza zużycie tlenu i metabolizm metaboliczny glukozy przez bocznik monofosforanu heksozy) zakłóca degranulację; w konsekwencji wpływa to na wewnątrzkomórkowe zabijanie drobnoustrojów przez fagocyty.

Degranulacja fagocytów w zawiesinie może być indukowana przez różne czynniki aktywujące i związki, które wpływają na cytoszkielet komórki (taki jak cytochalazyna B). Fagocyty uwalniają głównie drugorzędowe i trzeciorzędowe granulki i są mierzone metodami ELISA.

ja. Laktoferyna (wtórna granulka granulocytów obojętnochłonnych) jest stosowana jako marker wtórnego uwalniania granulek.

ii. Albumina jest oznaczana jako miara uwalniania trzeciorzędowej granuli.

Test na pierwotne uwalnianie granulek z fagocytów odbywa się poprzez poszukiwanie uwalniania pierwotnych granulek w zamknięte przestrzenie. "Sfrustrowana fagocytoza" jest testem stosowanym do oceny uwalniania pierwotnych granulek (ryc. 27.7).

Ogrzane kompleksy immunoglobulin lub immunologiczne są przymocowane do petridisu.

↓

Neutrofile są dodawane do szalki Petriego i inkubowane. Poprzez ich receptory Fc, neutrofile wiążą się z regionami Fc agregowanych cieplnie kompleksów immunoglobulin lub immunologicznych. W konsekwencji, neutrofile próbują fagocytozować zagregowane cieplnie immunoglobuliny lub kompleksy immunologiczne. Ale neutrofile nie mogą fagocytozy je (ponieważ są one przymocowane do płytki Petriego). W konsekwencji neutrofile uwalniają nad nimi swoją granulowaną zawartość.

↓

Szybkość uwalniania pierwotnych białek granulek, takich jak mieloperoksydaza lub β-glukoronidaza, jest stosowana do oszacowania degranulacji. Niedobory w syntezie pierwotnych / wtórnych granulek można również wykryć przez barwienie wewnątrzkomórkowych granulek znakowanymi mAb i cytometrią przepływową.

Bakteryjne zabijanie przez neutrofile:

Testy mikrobójcze są trudne do wykonania. Ogólnie, testy mikrobójcze są przeprowadzane, gdy bardziej proste testy nie dostarczają wystarczających informacji.

Szczep 502A szczepu Staphylococcus aureus jest powszechnie stosowany do oceny zdolności mikrobójczych neutrofili.

Staphylococcus aureus szczep 502A rosnący w fazie logicznej inkubuje się z ludzkimi surowicami (w celu dostarczenia immunoglobuliny i białek dopełniacza do działania jako opsoniny).

↓

Świeżo izolowane neutrofile dodaje się w stężeniu 5-10 bakterii / neutrofili.

↓

Po 30 minutach inkubacji bakterie, które nie są pochłonięte przez neutrofile, są zabijane przez dodanie gentamycyny. (Gentamidn nie wchodzi w neutrofile i dlatego bakterie fagocytowane pozostają żywe).

↓

Próbki granulocytow obojętnochłonnych usuwa się w odstępach 30-minutowych i miesza z jałową wodą destylowaną w celu zlizowania neutrofili i uwolnienia bakterii. Liczbę żywotnych bakterii w każdej podwielokrotności mierzy się przez seryjne rozcieńczenie i wysianie na płytkach agarowych z krwią.

↓

Wyniki są nanoszone na wykresie.

ja. Prawidłowe neutrofile wykazują zmniejszenie liczby żywotnych bakterii wewnątrzkomórkowych po 2 godzinach po jednej godzinie inkubacji.

ii. Praktycznie nie ma zabijania przez neutrofile od homozygotycznych pacjentów z CCD.

iii. Neutrofile od heterozygotycznych nosicieli CGD wykazują częściowe zabijanie przez neutrofile.