3 Klasyfikacje technik aglutynacji

Trzy typy, w których klasyfikuje się techniki aglutynacji komórek, to: 1. aglutynacja bezpośrednia, 2. aglutynacja pośrednia (pasywna) i 3. aglutynacja wsteczna (pasywna).

1. Bezpośredni test aglutynacji:

Komórki (takie jak bakterie, grzyby i erytrocyty) i nierozpuszczalne antygeny w postaci cząstek mogą być bezpośrednio aglutynowane przez ich swoiste przeciwciała. Przeciwciało ma dwa ramiona Fab, z którymi może wiązać się z antygenami na dwóch komórkach. Podobnie wiele cząsteczek przeciwciał wiąże się z wieloma komórkami tworząc sieć.

Ta sieć krystaliczna postrzegana jest wizualnie jako skupiska. Stąd tworzenie się grudek wskazuje na obecność wiązania antygen-przeciwciało. Brak aglutynacji wskazuje na brak reakcji antygen-przeciwciało.

Zastosowania testu bezpośredniego aglutynacji:

za. Identyfikacja drobnoustrojów:

Kolonie bakterii hodowane w pożywkach hodowlanych identyfikuje się stosując znane surowice odpornościowe przeciwko drobnoustrojom. Antybiotykowa surowica odpornościowa, która wytwarza widoczną aglutynację, identyfikuje bakterie.

b. Diagnostyka zakażeń drobnoustrojami poprzez wykrywanie obecności przeciwciał przeciwko drobnoustrojom w surowicy. Znane antygeny drobnoustrojów miesza się z surowicą pacjenta, a pojawienie się aglutynacji wskazuje na obecność przeciwciał surowicy przeciwko drobnoustrojowi.

do. ABO grupowanie krwi ludzkich erytrocytów (przy użyciu antysurowic).

Testy aglutynacji przeprowadza się na szkiełku (test aglutynacji szkiełkowej) lub w probówkach (test aglutynacji rurek).

ja. Test aglutynacji poślizgu jest prosty i łatwy do wykonania, a przeprowadzenie testu wymaga kilku minut.

ii. Test aglutynacji w probówce służy do ilościowej oceny ilości przeciwciał w surowicy przeciw drobnoustrojowi przez seryjne rozcieńczenie surowicy, a następnie zmieszanie rozcieńczonych surowic ze stałą ilością antygenów drobnoustrojowych. Po odpowiedniej inkubacji najwyższe rozcieńczenie surowicy wykazujące widoczną aglutynację przyjmuje się jako miano surowicy (na przykład, test w probówce Widal, test probówki Brucella). Miano odzwierciedla stężenie przeciwciał w surowicy; wyższe miano, więcej to stężenie przeciwciał.

Testy ślizgowe do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko czynnikom zakaźnym są stosowane jako wstępne testy przesiewowe. Surowice dodatnich testów ślizgowych powinny zostać ponownie przetestowane testami probówek, aby potwierdzić wyniki testu ślizgowego. Badanie przesiewowe może dać mylące wyniki, szczególnie przy bardzo wysokich poziomach przeciwciał w surowicy (np. Zjawisko prozone z przeciwciałami brucella).

W testowych systemach aglutynacji występuje znaczna wewnętrzna zmienność. Stąd, gdy wartości miana surowicy pacjenta są sprawdzane dwukrotnie, różnica między wartościami miana jest znacząca, tylko wtedy, gdy wartości miana różnią się co najmniej dwoma podwójnymi rozcieńczeniami [lub różnicą o dwie probówki (czterokrotność pierwszej wartości) ] (np. W teście na rurkę Widal surowicę rozcieńcza się w dwóch fałdach: 1 na 20, 1 na 40, 1 na 80, 1 na 160, 1 na 320 i 1 na 640. Jeśli pacjent ma pierwszy test Widal miano 1 na 160, drugie widmowe miano testowe jest znaczące, jeśli wynosi 1 na 640 lub więcej niż 1 na 640.)

Test na przeciwciała heterofile:

(Często określany jako test jednopunktowy) Heterofile test przeciwciała jest testem hemaglutynacji do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi Epsteina Barr (EB), który powoduje chorobę zakaźną mononukleozy. Przeciwciała IgM utworzone podczas mononukleozy zakaźnej krzyżują się z antygenami powierzchniowymi RBC koni (prawdopodobnie z powodu podobieństwa antygenowego między wirusem EB a białkami powierzchniowymi z krwinek koniowatych) i powodują hemaglutynację.

Test aglutynacji pośredniej (pasywnej):

W pośrednim teście aglutynacji znane rozpuszczalne antygeny są powlekane innymi komórkami (np. Erytrocytami owcy lub indyka) lub obojętnymi cząstkami (np. Lateks, bentonit, węgiel drzewny, polistyren), które działają jako pasywne nośniki antygenów.

Wiele antygenów można pokryć erytrocytami bezpośrednio lub po obróbce erytrocytów formaliną, kwasem taninowym lub glutaraldelydem. Zaletą stosowania erytrocytów do powlekania jest ich łatwa dostępność i możliwość przechowywania. Ponadto testy te są bardzo czułe.

Testowana surowica jest mieszana ze znanymi erytrocytami lub lateksem pokrytymi antygenem.

↓

Jeśli badana surowica ma przeciwciała, erytrocyty lub cząsteczki lateksu aglutynują i wytwarzają widoczne grudki.

Test hemaglutynacji:

Testy hemaglutynacji są proste i łatwe do wykonania. Zarówno testy jakościowe, jak i ilościowe można wykonywać za pomocą techniki hemaglutynacji.

Surowicę testową rozcieńcza się seryjnie w roztworze rozcieńczającym w dołkach płytki mikrotitracyjnej.

↓

RBC powleczone znanym antygenem dodaje się w równych objętościach do wszystkich dołków. Stosuje się odpowiednią kontrolę pozytywną, kontrolę negatywną i kontrolę odczynnika. Płytkę dobrze wstrząsa się i inkubuje w miejscu wolnym od wibracji.

↓

Po inkubacji płytkę odczytuje się gołym okiem w celu aglutynacji.

Reakcja pozytywna:

Studzienki z aglutynacją wskazują na wiązanie się z RBC pokrytymi antygenem odpowiednimi przeciwciałami w badanej surowicy. Dno aglutynowanej studzienki opisuje się jako wygląd dywanu.

Negatywna reakcja:

W studzienkach, w których nie ma wiązania antygen-przeciwciało, aglutynacja RBC nie występuje. Z powodu grawitacji, RBC osadzają się na dnie studzienek i dają "przycisk" jak wygląd, przy czym krawędź "przycisku" jest ostra i regularna.

Miano przeciwciał surowicy testowej:

Rozcieńczenie surowicy, które daje 50% aglutynację w porównaniu z studzienką wykazującą pełną (100 procent) aglutynację, oznacza miano przeciwciał surowicy testowej. Zestawy do hemaglutynacji są dostępne do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B, HIV, tyreoglobuliny itp.

Aglutynacja cząstek żelatyny:

Cząstki żelatyny są alternatywą dla erytrocytów w testach aglutynacji cząstek. Specjalne cząstki żelatyny (o średnicy około 3 μm) mają silnie hydrofilową powierzchnię, a zatem nie ma niespecyficznego wiązania materiałów obecnych w próbce. Cząstki żelatyny wytwarza się przez rozdzielanie faz i trójwymiarowe sieciowanie w 40 ° C. Otrzymane cząstki utrwalono za pomocą formaldehydu lub aldehydu glutarowego.

Cząstki żelatyny nie mają antygenowości, a zatem są wolne od problemów związanych z testami hemaglutynacji (takich jak przeciwciała heterofilne, które mogą reagować niespecyficznie z RBC i dają fałszywie dodatnie aglutynacje w testach hemaglutynacji).

Test aglutynacji lateksu:

Oprócz erytrocytów i żelatyny niewiele innych cząstek można również stosować do przenoszenia antygenów na ich powierzchni. Takie powleczone antygenem cząstki będą aglutynować po zmieszaniu ze specyficznymi przeciwciałami. Antygeny białkowe i polisacharydowe można powlekać cząstkami lateksu. Te powleczone antygenem cząstki będą aglutynować w obecności przeciwciał.

Test odwrotnej pasywnej hemaglutynacji:

W testach odwrotnej pasywnej hemaglutynacji, RBC pokrywa się znanymi przeciwciałami. Zestawy te są używane do wykrywania antygenów w testowanych próbkach, takich jak HBs Ag w surowicy.

Test Rose-Waaller:

Jest to pasywny test hemaglutynacji w celu wykrycia czynnika reumatoidalnego. Jedną z cech ludzkiego czynnika reumatoidalnego jest to, że może on wiązać się z ludzką IgG, jak również króliczą IgG. Owcze erytrocyty są powlekane subaglutynującymi ilościami przeciwciał anty-owczych IgG (hodowanych u królika). Czynniki reumatoidalne aglutynują owcze erytrocyty pokryte króliczymi anty-owczymi IgG.

Test flokulacji:

Flokulacja jest innym rodzajem testu tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało, stosowanego do wykrywania i ilościowego oznaczania przeciwciał. W przeciwieństwie do aglutynacji i wytrącania (przy czym kompleksy antygen-przeciwciało osiadają na dnie probówki), w teście kłaczkowania kompleksy antygen-przeciwciało agregują i pozostają w zawiesinie jako kłaczki, a wyniki odczytuje się pod mikroskopem. Technika ta jest używana w teście VDRL (test laboratoryjny w chorobach wenerycznych) do wykrywania przeciwciał przeciwko Treponema pallidum, bakteriom, które powodują kiłę.

Hemaglutynacja wirusowa:

Hemaglutynacja wirusowa jest specjalną kategorią aglutynacji erytrocytów, która nie obejmuje reakcji antygen-przeciwciało. Niektóre wirusy wiążą się z białkami powierzchniowymi krwinek czerwonych, a wiązanie to prowadzi do spontanicznej aglutynacji krwinek czerwonych.

Spontanicznej aglutynacji RBC przez wirus można zapobiegać przez specyficzne przeciwciała przeciwwirusowe. Przeciwciała przeciwko wirusowi wiążą się z wirusowymi antygenami powierzchniowymi i zapobiegają interakcji wirusa i RBC, a w konsekwencji RBC nie ulegają aglutynacji. Nazywa się ją testem zahamowania hemaglutynacji i jest stosowany do ilościowego oznaczania przeciwciał wirusowych w surowicy pacjentów.

Test na aglutyniny zimne:

Przeciwciała powstałe podczas pewnych infekcji (szczególnie Mycoplasma pneumoniae) i chorób autoimmunologicznych mają szczególną zdolność do aglutynacji erytrocytów w 4 ° C. Te przeciwciała są nazywane zimnymi aglutyninami.

Seryjne rozcieńczenia surowicy pacjenta inkubuje się z 1% RBC w 4 ° C przez noc.

↓

Probówki są badane na obecność aglutynacji. Jeśli występuje aglutynacja, probówki są ponownie inkubowane w 37 ° C.

↓

Deaglutynacja RBC w 37 ° C wskazuje, że surowica ma zimne aglutyniny. Test zimnej aglutyniny służy do diagnozowania zakażenia Mycoplasma pneumoniae. 50 do 80 procent pacjentów z ostrymi zakażeniami Mycoplasma pneumoniae ma zimną aglutyninę należącą do typu IgM.