Testy komplementacji antygenów i przeciwciał

Testy uzupełniające antygenów i przeciwciał!

Dostępne są metody dokładnego określania każdego ze składników dopełniacza wszystkich trzech szlaków aktywacji dopełniacza oraz kilku enzymów i regulatorów układu dopełniacza.

Jednak wiele testów jest dostępnych tylko w laboratoriach badawczych.

Istnieją dwa rodzaje testów dopełniacza:

1. Testy, które mierzą białka dopełniacza jako antygeny.

2. Testy mierzące aktywność funkcjonalną dopełniacza.

Testy, które mierzą białka dopełniacza jako antygeny są na ogół proste do wykonania, tanie, mniej czasochłonne i mogą być wykonane w wielu laboratoriach. Ale te testy antygenowe nie dostarczają informacji o funkcjonalnych możliwościach składników dopełniacza, ponieważ te uzupełniające testy antygenowe wykrywają zarówno funkcjonalnie aktywne składniki dopełniacza, jak i produkty degradacji dopełniacza.

ja. Ogólnie testy antygenowe nie są tak czułe, jak testy funkcjonalne.

ii. Testy antygenowe nie wykrywają niskiego poziomu składników dopełniacza w niektórych płynach ustrojowych.

iii. Testy ELISA są dostępne do pomiaru podzielonych produktów składników dopełniacza lub kompleksów, które tworzą się podczas aktywacji dopełniacza.

iv. Aktywację dopełniacza za pośrednictwem szlaku klasycznego można zmierzyć, obserwując poziomy C4d i C4 w surowicy.

v. Pomiar ELISA kompleksów C1r-C1s-C1INH zapewnia miarę aktywacji dopełniacza klasyczną drogą.

vi. Aktywację alternatywnego szlaku można zmierzyć metodą ELISA, oceniając poziomy kompleksów Bb lub C3bBbP w krążeniu.

vii. Aktywacja szlaku klasycznego lub alternatywnego może być monitorowana przez pomiar poziomów iC3b lub rozpuszczalnej postaci kompleksu sC5b6789 atakującego błonę.

viii. Dostępne są zestawy ELISA do pomiaru anafylotaksyny C3a i C5a w surowicy lub osoczu.

Obróbka próbki w badaniach komplementarnych:

Właściwe postępowanie z próbkami ma kluczowe znaczenie dla testów funkcjonalnych dopełniacza. Niektóre składniki dopełniacza są wysoce nietrwałe.

ja. W przypadku większości testów czynnościowych raczej korzystna jest surowica niż osocze, ponieważ chelatory wapnia (takie jak EDTA, heparyna) stosowane do uzyskania osocza mogą być anty-komplementarne.

ii. W przypadku testów czynnościowych krew powinna krzepnąć w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, a następnie na lodzie przez co najmniej godzinę.

iii. W przypadku testów wiązania Clq krew powinna krzepnąć przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Skrzep jest oprawiany i odwirowywany w temperaturze od 0 ° C do 4 ° C przez pięć minut. Jeśli podejrzewa się krioprecypitację przeciwciał, tworzenie się skrzepu i wirowanie krwi należy wykonywać w temperaturze 37 ° C, ponieważ wiązanie dopełniacza może wystąpić, jeśli próbka jest schłodzona.

iv. Próbki surowicy lub osocza należy podzielić na małe porcje i przechowywać natychmiast w temperaturze od 40 do -80 ° C.

v. Po przeniesieniu surowicy należy je dobrze uszczelnić i umieścić w pojemnikach z dużą ilością suchego lodu.

Testy uzupełniające funkcjonalne:

Bufory stosowane w funkcyjnych testach dopełniacza są krytyczne, ponieważ zmiany stężeń molowych i jonów metali mogą wpływać na wartości miana dopełniacza. Test CH50 dla klasycznego szlaku dopełniacza: Najprostszy test czynnościowy klasycznego szlaku mierzy całkowity dopełniacz hemolityczny.

Brak jakiegokolwiek składnika dopełniacza powoduje całkowite zniesienie miana dopełniacza hemolitycznego (CH ₅₀ ). Owcze erytrocyty są na ogół stosowane jako komórki docelowe do pomiaru CH50 lub aktywności funkcjonalnej izolowanych składników dopełniacza. Komórki RBC owcy są bardziej wrażliwe na lizę zależną od przeciwciał i zależną od układu dopełniacza niż na RBC innych gatunków.

Test AH50 dla alternatywnego szlaku dopełniacza:

Erytrocyty królika są używane do pomiaru AH ₅₀ . Krwinki RBC królika są wrażliwe na lizę niezależną od przeciwciał, w której pośredniczy ludzka surowica.

ja. Testy CH50 i AH50 są doskonałymi testami przesiewowymi, aby wykluczyć niedobór genetyczny składników dopełniacza.

ii. Normalna aktywność CH50 ze zmniejszonymi wartościami AH50 wynika z wad alternatywnego szlaku dopełniacza.

iii. Niedociągnięcia w końcowych elementach dopełniacza powodują utratę aktywności CH ₅₀ i AH ₅₀ .

iv. Homozygotyczny niedobór składnika dopełniacza całkowicie znosi test hemolityczny.

Na stopień hemolizy wpływa wiele czynników, takich jak stężenie erytrocytów, kruchość (wiek) erytrocytów, ilość przeciwciała użytego do uczulenia, rodzaj przeciwciała (IgG lub IgM), siła jonowa układu buforowego, P ^H, czas reakcji, temperatura i stężenia wapnia ²⁺ lub magnezu ²⁺ . Wartość jednostek CH50 w ludzkiej surowicy jest obliczana na kilka sposobów, na przykład równanie Von Krough.

Pomiar niedoboru funkcjonalnego poszczególnych składników dopełniacza:

Jeżeli historia pacjenta i objawy sugerują możliwy niedobór składnika dopełniacza, może być wymagane hemolityczne miareczkowanie poszczególnych składników. Aby wytworzyć lizę erytrocytów, konieczna jest obecność i aktywacja wszystkich składników dopełniacza (C1 - C9). Jeśli jakikolwiek składnik jest nieobecny, hemoliza nie występuje. Czyste preparaty każdego z poszczególnych komponentów układu dopełniacza są potrzebne do wykrycia braku określonego składnika dopełniacza w surowicy lub osoczu pacjenta.

Do pomiaru pojedynczych składników dopełniacza wymagane są częściowo oczyszczone składniki. Jednak pomiar C4 jest wyjątkiem, ze względu na dostępność surowicy świnki morskiej pozbawionej C4 (C4D). Surowice od ludzi z niedoborem C2 i świnek morskich oraz królików z niedoborem C6 są dostępne w kilku laboratoriach.

Funkcjonalne testy dopełniacza poszczególnych składników są wrażliwe i dostarczają dokładnych informacji o aktywności składnika dopełniacza. Ale większość z tych testów ogranicza się do laboratoriów badawczych.

Pomiar pojedynczego składnika komplementarnego za pomocą analizy antygenów:

Pojedyncza radialna dyfuzja immunologiczna jest najczęstszą metodą oceny ilościowej składników dopełniacza, takich jak C3, C4 i czynnik B. Należy pamiętać, że wszystkie funkcjonalne testy dopełniacza mogą być hamowane przez anty-komplementarne działanie surowicy (co może wynikać z antygenów. kompleksy przeciwciał, heparyna, czynniki chelatujące i zagregowana immunoglobulina).

Test utrwalenia połączenia:

Gdy występuje interakcja antygen-przeciwciało, składniki dopełniacza są aktywowane i konsumowane. Zatem test in vitro na obecność dopełniacza wskazuje na obecność interakcji antygen-przeciwciało. Zasada ta służy do wykrywania i pomiaru antygenu lub przeciwciał w teście wiązania dopełniacza.

Test przeprowadza się w dwóch etapach. W pierwszym etapie dochodzi do interakcji antygen-przeciwciało, a dopełniacz jest zużywany. W drugim etapie stosuje się system wskaźników do wykrywania, czy dopełniacz jest zużywany czy nie w reakcji pierwszego stopnia.

ja. Jeśli dopełniacz jest spożywany w pierwszym etapie, oznacza to, że reakcja antygen-przeciwciało wystąpiła w pierwszym etapie.

ii. Jeśli dopełniacz nie jest spożywany, oznacza to, że nie było interakcji antygen-przeciwciało w pierwszym etapie.

Wykrywanie przeciwciała za pomocą testu naprawczego komplementacji:

Pierwszy etap:

Stałe stężenia znanych antygenów i dopełniacza (zwykle świeża surowica świnki morskiej jest używana jako źródło dopełniacza). Dodano surowicę zawierającą (nieznane przeciwciała) i inkubowano.

A. Znane antygeny + dopełniacz + surowica (obecne odpowiednie przeciwciała). Dopełniacz jest zużywany podczas inkubacji.

B. Znana surowica antygen + dopełniacz -1 (brak odpowiednich przeciwciał). Dopełniacz nie jest spożywany, ponieważ surowica nie zawiera przeciwciał specyficznych dla znanego antygenu.

Drugi etap:

Do probówek dodaje się erytrocyty owcze opłaszczone króliczymi przeciwciałami przeciwko erytrocytom owiec. W obecności dopełniacza erytrocyty owcy ulegają lizie (hemoliza). W przypadku braku dopełniacza erytrocyty nie ulegają lizie (brak hemolizy).

A. Ponieważ dopełniacz jest stosowany podczas pierwszego etapu reakcji, erytrocyty owcy pokryte przeciwciałami nie są lizowane. Dlatego też brak hemolizy sugeruje, że surowica zawiera swoiste przeciwciała przeciwko antygenowi stosowanemu w teście.

B. Ponieważ dopełniacz nie jest stosowany w pierwszym etapie, erytrocyty owiec owinięte przeciwciałem są zhemolizowane przez dopełniacz w drugim etapie. Dlatego obecność hemolizy sugeruje, że surowica nie zawiera swoistych przeciwciał przeciwko używanemu antygenowi.

Testy wiązania dopełniacza są szeroko stosowane w laboratoriach klinicznych i badaniach. Wirusy, przeciwciała surowicy przeciwko infekcjom wirusowym, przeciwciała przeciwko Treponema pallidum, które powodują kiłę, przeciwciała przeciwgrzybicze (kokcydioidomikoza, zapalenie błony śluzowej, Histoplasma capsulatum), przeciwciała przeciwko Mycoplasma pneumoniae i przeciwciała anty-riketsyjne są wykrywane przez test wiązania dopełniacza.