Test immunoabsorbentu związanego z enzymem (ELISA) Metody wykrywania antygenu

Test immunoabsorbentu związanego z enzymem (ELISA) Metody wykrywania antygenu!

W celu wykrycia antygenu lub przeciwciała można użyć metody immnchłonnej związanej z enzymem. Metoda ELISA ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami (Tabela 27.2).

Metoda ELISA jest wrażliwa na 10 do 1000-krotnie niż w przypadku starszych metod, takich jak aglutynacja i immunoelektroforeza. Dostępne są różne modyfikacje testu ELISA, z których niektóre opisano tutaj.

Tabela 27.2: Zalety oznaczeń immunologicznych enzymów

1. Efekt amplifikacji enzymów powoduje rozwój bardziej czułych testów

2. Odczynniki mają długi okres trwałości i są stosunkowo tanie

3. Można opracować szeroką gamę konfiguracji testu

4. Sprzęt jest mniej kosztowny i dostępny powszechnie

5. Brak zagrożeń radiacyjnych

6. Może być wykonywany również w małych laboratoriach

ELISA do oznaczania przeciwciał:

Znany antygen powleczony jest do dołków płytki mikrolitrowej (mała plastikowa płytka, poddana obróbce w celu zmaksymalizowania wiązania białka, zawierająca 96 studzienek o objętości 200 μl).

↓

Ludzką surowicę testową dodaje się do studzienki i inkubuje.

ja. Jeśli surowica zawiera przeciwciała przeciwko powleczonemu antygenowi, przeciwciała wiążą się z antygenami.

↓

Studzienki są przemywane w celu usunięcia niezwiązanych składników surowicy.

↓

Enzym sprzężoną z anty-ludzką immunoglobuliną (znaną jako koniugat) dodaje się do studzienek i inkubuje.

ii. Koniugat wiąże się z przeciwciałami związanymi z antygenem w studzience.

iii. Jeśli surowica testowa nie zawiera przeciwciał przeciwko antygenowi, koniugat pozostaje w roztworze.

↓

Studzienki przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu.

↓

Odpowiedni substrat dodaje się do studzienek i inkubuje.

iv. Enzym koniugatu w kompleksie antygen-przeciwciało-koniugat działa na podłoże i rozszczepia substrat, tworząc barwny produkt. Rozwój koloru wskazuje, że przeciwciało swoiste dla antygenu powleczonego na studzienkach jest obecne w badanej surowicy.

v. Brak rozwoju koloru wskazuje, że badana surowica nie ma przeciwciał przeciwko antygenowi pokrytemu w studzienkach.

↓

W celu zatrzymania reakcji dodaje się roztwór zatrzymujący (zwykle IN kwas siarkowy). Następnie płytkę trzyma się w czytniku ELISA i mierzy się gęstość optyczną (OD) studzienek. OD odpowiada ilości przeciwciała w badanej surowicy.

Dzięki zastosowaniu znanych stężeń przeciwciał można skonstruować wykres. Stężenia przeciwciał wykreślono na osi X, a odpowiadające im OD nakreślono na osi Y i narysowano krzywą. Poprzez interpolację wartości OD badanej surowicy określa się stężenie przeciwciał w badanej surowicy.

ELISA do badania antygenu:

Znane przeciwciało monoklonalne (określane jako pierwszorzędowe przeciwciało) na antygen powleka się w studzienkach do mikromiareczkowania.

↓

Próbkę zawierającą antygen dodaje się do dołka i inkubuje.

ja. Jeśli próbka zawiera odpowiedni antygen, antygen wiąże się z przeciwciałem w studzience i tworzy kompleks antygen-przeciwciało.

↓

Studzienki są przemywane w celu usunięcia niezwiązanych materiałów.

↓

Do studzienek dodaje się znany skoniugowany z enzymem mAb (nazywany koniugatem) przeciw antygenowi i płytkę inkubuje się.

ja. Jeśli studzienka zawiera kompleks antygen-przeciwciało, koniugat wiąże się z antygenem w kompleksie.

ii. Jeśli nie ma kompleksu antygen-przeciwciało, koniugat pozostaje w roztworze.

↓

Studzienki są przemywane w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu. Dodaje się odpowiedni substrat i inkubuje.

ja. Jeśli w zagłębieniu występuje koniugat, enzym koniugatu dzieli podłoże i wytwarza kolorowy produkt.

iii. Brak rozwoju koloru wskazuje, że w próbce nie ma antygenu (w stosunku do przeciwciała pokrytego w studzienkach).

↓

Dodaje się roztwór zatrzymujący w celu zatrzymania reakcji. OD poszczególnych studzienek odczytywano w czytniku ELISA. Jak wyjaśniono wcześniej, skonstruowano wykres (składający się z różnych stężeń antygenów na osi X i odpowiednich OD na osi Y) i narysowano krzywą. Stężenie antygenu w badanej próbce określa się przez interpolację jego OD.

Metoda ELISA przechwytująca przeciwciała:

Dołki z płytki do mikromiareczkowania powleczono przeciwciałami przeciw ludzkiemu IgM.

↓

Dodaje się surowicę pacjenta i inkubuje. Przeciwciała IgM w surowicy wiążą się z przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM w studzienkach.

Studzienki są przemywane, a następnie dodaje się znany antygen i inkubuje.

ja. Jeśli przeciwciała IgM przeciwko antygenowi są obecne w dołku, antygen będzie wiązał się z przeciwciałem IgM i pozostaje w studzience.

↓

Studzienki są przemywane w celu usunięcia niezwiązanego antygenu

↓

Koniugowane z enzymem mAb do antygenu dodaje się i inkubuje.

ja. Jeśli antygen jest obecny w studzience (kompleks anty-IgM-antygen), koniugat będzie wiązał się z antygenem.

↓

Studzienki przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu i dodaje się substrat.

ja. Rozwój koloru wskazuje, że przeciwciała IgM przeciwko antygenowi są obecne w surowicy pacjenta.

ii. Brak rozwoju koloru wskazuje, że surowica pacjenta nie zawiera przeciwciał IgM przeciwko antygenowi.

↓

Dodano roztwór zatrzymujący, a OD studzienek mierzono indywidualnie w czytniku ELISA. Ilość przeciwciał IgM przeciwko antygenowi można określić przez narysowanie wykresu, jak opisano wcześniej.

Podobną procedurę można zastosować do wykrywania przeciwciał IgG przeciwko antygenowi.

Enzymami powszechnie stosowanymi w technikach ELISA są peroksydaza chrzanowa i fosfataza alkaliczna (Tabela 27.3). Enzymy te są kowalencyjnie sprzężone z mAb. Różne enzymy działają na te enzymy, tworząc barwne produkty. Ponieważ ostatni etap metody ELISA jest enzymatyczny, metoda ELISA jest wyjątkowo czuła (tj. Wykrywalne są bardzo niskie stężenia antygenu lub przeciwciała).

Czułość testów ELISA jest zwiększona przez zastosowanie dodatkowych odczynników (na przykład biotyna / test na obecność awidynawirusa). Ostatnio zastosowanie substratów peroksydazy chrzanowej, które wytwarzają produkty chemiluminescencyjne, jeszcze bardziej zwiększyło czułość. Pomiar szybkości reakcji, a nie zakresu reakcji w pojedynczej ustalonej chwili, daje dokładniejsze wyniki ilościowe ELISA.

Tabela 27.3: Charakterystyka enzymów stosowanych w immunotestach enzymatycznych:

Udoskonalony test ELISA biotyna-awidyna:

Zamiast znakowania mAb enzymem, MAb można znakować biotyną (witamina B ₁₂ ).

↓

Następnie dodaje się znakowaną enzymem awidynę (składnik białkowy białka jaja).

↓

Awidyna wiąże się z biotyną z bardzo wysoką czułością i powinowactwem. Następnie dodaje się substrat. Enzym (w kompleksie mAb-biotyna-awidyna-enzym) działa na substrat i wytwarza kolorowy produkt.

Wzmocnienie biotyna-awidyna jest również stosowane w testach immuno-fluorescencyjnych.

Analizy immunologiczne enzymu mikrocząsteczkowego:

Zamiast powlekania studzienek płytki mikrotitracyjnej antygenami lub przeciwciałami, małe kulki (o średnicy 1 mm) powleczono antygenem lub przeciwciałem i przeprowadzono testy ELISA. Mikrocząstki oferują większą powierzchnię dla powleczenia antygenem lub przeciwciałem, dzięki czemu można powlec większe stężenia antygenu lub przeciwciała, co pomaga skrócić czas wymagany do reakcji wiązania.

Test immunoenzymatyczny fluorescencyjny jest identyczny z innymi OOŚ, z tą różnicą, że używają substratów fluorescencyjnych. W fluorescencyjnej EIA, fluorofor jest generowany przez reakcję enzymatyczną. Po wzbudzeniu fluoroforu przy jego optymalnej długości fali emitowane jest światło o charakterystycznej długości fali. Emitowane światło fluorescencyjne jest mierzone.

Wyrażony w czasie test fluoroimmunologiczny:

Ta metoda wymaga specjalnego oprzyrządowania i specjalnych etykiet fluorescencyjnych, aby zwiększyć czułość testu. Znak fluorescencyjny stosowany w tym teście wykazuje opóźnioną fluorescencję z czasem 100 ns lub więcej pomiędzy wzbudzeniem i emisją. Większość substancji odpowiedzialnych za fluorescencję tła ma krótki okres zanikania. Dlatego pomiar opóźnionego sygnału fluorescencji zmniejszy efekty fluorescencji tła.

Cel ten osiąga się dzięki zastosowaniu specjalnego fluoroskopu z czasowym rozdzielczością, który wytwarza szybki impuls świetlny, który pobudza fluorofor. Fluorescencję mierzy się trochę po wzbudzeniu. W ten sposób można wyeliminować wpływ niespecyficznego tła, które zwykle rozpada się w czasie poniżej 10 ns.

Fluorofory wykazujące opóźnioną fluorescencję to:

ja. Pochodne pirenu o czasie rozpadu wynoszącym prawie 100 ns.

ii. Etykiety chelatujące z metali ziem rzadkich [takie jak europ (Eu ³⁺ ), samar (Sm ³⁺ ) i terb (Tb ³⁺ )], które mają bardzo długi czas zaniku około 50 do 100 μs.

Chemiluminescencyjny test immunologiczny:

Chemiluminescencyjne testy immunologiczne (CL-EIA) wykorzystują substraty chemiluminescencyjne, które reagują z różnymi enzymami. Chemiluminescencyjna reakcja substrat-enzym wytwarza światło podobne do bioluminescencji. Chemiluminescencyjne systemy EIA stanowią zdecydowaną poprawę w stosunku do OSR pod względem czułości, wydajności czasowej i prostoty proceduralnej.

Testy immunologiczne chemiluminescencyjne wykorzystują cząsteczki generujące chemiluminescencję jako znaczniki.

ja. Pochodne luminolu

ii. Estry kwasu akrydynowego

iii. Pochodne szczawianu nitrofenylu

iv. Ruteno-tri-bipridyl z tripropyloaminą do elektrochemiluminescencji

v. Zasadniczo metody testowe nie różnią się od metod RIA / FIA.