Immunodyfuzja antygenu lub przeciwciał

Immunodyfuzja antygenu lub przeciwciał!

Immunodyfuzja dotyczy ruchu antygenu lub przeciwciała lub obu cząsteczek antygenu i przeciwciała w nośniku przez dyfuzję.

Antygen i przeciwciało wiążą się ze sobą i tworzą nierozpuszczalny immuno-precypitat, który jest widoczny gołym okiem jako prążek lub linia precypitacyjna. J. Oudin opisał układ pojedynczej dyfuzji antygenu i przeciwciała w probówkach wypełnionych agarem.

Wkrótce Ouchterlony opisał podwójną dyfuzję na agarze, ułożoną warstwowo na szkiełkach. Ruch jest również opisany jako liniowy lub radialny. Metody immunodyfuzji są stosowane do jakościowej i ilościowej analizy białek surowicy. Jednak bardziej czułe i specyficzne metody, takie jak enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA) i radioimmunologiczny (RIA) prawie zastąpiły metody immunodyfuzji.

Pojedyncza immunodyfuzja:

Albo antygen, albo przeciwciało pozostaje utrwalone, a drugi reagant się porusza (technika dyfuzji Oudina).

Podwójna immunodyfuzja:

Zarówno antygen jak i przeciwciało mogą swobodnie poruszać się ku sobie. (Technika Ouchterlony).

Stopiony agar wylewa się na szkiełko lub petridish i pozostawia do zestalenia. Wykonywane są dwie małe studnie w odległości kilku milimetrów od siebie. Antygen i odpowiednie roztwory przeciwciał są upuszczane w przeciwległych dołkach. Slajd / petridish jest następnie przechowywany w wilgotnej komorze przez 18-24 godzin. Antygen i przeciwciało przechodzą przez agar i łączą się, tworząc kompleks antygen-przeciwciało. Kompleks antygen-przeciwciało jest widoczny jako linia opadów.

Podwójna dyfuzja jest również wykonywana przez umieszczenie studzienek antygenów i przeciwciał pod różnymi kątami dla celów porównawczych. Trzy wzorce tych reakcji przedstawiono na rysunku 27.2.

ja. Reakcja tożsamości:

Antygeny w dwóch dołkach są identyczne (Agl i Ag2). Tak więc reakcja z przeciwciałem daje dokładnie podobne linie precypitatu. Linie precypityny nie krzyżują się, ale tworzą ciągłą linię. Fuzja dwóch linii precypitynowych wskazuje, że przeciwciało reaguje z epitopami powszechnie obecnymi na dwóch antygenach.

ii. Reakcja na brak tożsamości:

Dwa nieidentyczne antygeny (Agl i Ag3) znajdują się w studzienkach antygenowych, podczas gdy studzienka przeciwciała ma przeciwciała przeciwko obu antygenom. Wytworzone dwie linie precypitatu antygen-przeciwciało różnią się od siebie. W związku z tym obie linie precypityny całkowicie krzyżują się (przecinają) ze sobą.

iii. Reakcja częściowej tożsamości:

Determinanty antygenowe w antygenach dwóch studzienek są częściowo podzielone (Agl i Agla). W związku z tym przeciwciało reaguje z obydwoma antygenami i tworzy linie, które nie tworzą pełnego krzyża. Linia precypityny przecina się tylko w jednym kierunku. Rozszerzona linia precypityny jest określana jako ostroga. Ostroga wskazuje, że przeciwciało wytrąca także dodatkowy epitop, który nie jest obecny w jednym z antygenów.

Podwójną immunodyfuzję można również zastosować do półilościowej analizy antygenu lub przeciwciała (ryc. 27.3):

Ryc. 27.3:

Podwójna immunodyfuzja do półilościowej analizy antygenu. Przeciwciało umieszcza się w centralnej studzience, a antygen umieszcza się w różnych stężeniach w peryferyjnych studzienkach

ja. Oznaczenie ilościowe antygenu:

Antygen X rozcieńcza się seryjnie i umieszcza w studzienkach otaczających centralną studzienkę, w której umieszczone jest przeciwciało anty-X. Antygen i przeciwciało dyfundują ze studzienek i reagują ze sobą, powodując powstawanie linii precypitynowych pomiędzy studzienkami antygenu i przeciwciała. Ilość osadu antygen-przeciwciało zmniejsza się wraz ze zmniejszaniem ilości antygenów w różnych studzienkach. W związku z tym grubość linii precypityny maleje wraz ze spadkiem stężenia antygenu.

ii. Oznaczenie ilościowe przeciwciała:

Stosuje się procedurę podobną do oznaczania ilościowego antygenu, z tą różnicą, że zmienia się pozycja antygenu i przeciwciała. Antygen umieszcza się w centralnej studzience i przeciwciało w różnych rozcieńczeniach umieszcza się w zewnętrznych studzienkach.

Pojedyncza immunodyfuzja promieniowa:

Mancini przedstawił tę nową technikę dokładnego oznaczania ilościowego antygenów. Przeciwciało miesza się ze stopionym agarem i wlewa na płytkę Petriego. Po zestaleniu agaru wycina się studzienki i napełnia je różnymi stężeniami antygenu (ryc. 27.4).

Antygen dyfunduje ze studzienki i tworzy osad antygen-przeciwciało w ciągu 48-72 godzin. Osad widziany jest jako biała okrągła linia wokół każdej studzienki. Średnica okrągłego pierścienia jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu (tj. Więcej stężenia antygenu, średnica osadu jest większa).

Standardową krzywą można wykreślić na wykresie, wykreślając znane stężenia antygenu w osi X i średnice w osi Y. Badany antygen, którego stężenie nie jest znane, można oznaczyć przez interpolację krzywej standardowej ze średnicą osadu utworzonego przez badany antygen.

Czułość tej metody wynosi 1-3 μg / ml antygenu. Metodę tę stosuje się do ilościowego oznaczenia stężeń IgG, IgM lub IgA (przez włączenie do przeciwciał anty-IgA, anty-IgM lub anty-IgA odpowiednio).